前 言
糖尿病患病人数及发病机制
糖尿病是一种多基因遗传性疾病，胰岛素分泌不足和胰岛素抵抗是其主要的病理特征，胰岛素是人体控制血糖的关键，主要是由胰岛β细胞分泌的，当胰岛β细胞功能缺失或者凋亡时，胰岛素分泌减少，人体中血糖不能有效的降下来，血糖长期处于较高的状态是引发糖尿病的关键因素之一。糖尿病分为 1 型糖尿病和 2 型糖尿病，1 型糖尿病主要由于自身免疫对β细胞进行攻击使β细胞死亡，从而自身胰岛素分泌不足，导致血糖浓度升高。2 型糖尿病引发高血糖是由多种因素的综合的结果，其中以胰岛素抵抗和胰岛β细胞分泌功能障碍为主要因素：(1).胰岛素受体缺陷致使肌肉、脂肪等组织摄取葡萄糖量减少，导致血糖增高。(2).胰岛素相对不足或拮抗胰岛素增多使肝糖元分解及糖元异生增多，导致肝糖输出增多。(3).胰岛β细胞缺陷导致胰岛素分泌不足，引起高血糖。(4).长期的高血糖状态刺激胰岛β细胞分泌，最终导致β细胞功能迅速衰竭[1]。现代研究表明：在高血糖高血脂状态下会诱导β细胞凋亡，血脂高的人比血脂低的人更容易患糖尿病，患有肥胖以及代谢综合征等会使糖尿病的发病率大大增加。目前治疗 2 型糖尿病药物种类很多，各类药物均有一定的作用，但各类药物均有其局限性及副作用。因此，开发保护胰岛β细胞的药物，特别是寻找低毒副作用的天然活性产物仍具有较高的研究意义。
五没食子酰基葡萄糖近期研究进展
五没食子酰基葡萄糖（简称β-PGG），其广泛存在于中药中，属于多酚类化合物，是单宁中的重要组成部分，也是许多收涩类中药的重要成分之一，其味微涩[2]。β-PGG 是由 5 分子的没食子酰基和 1 分子葡萄糖结合而成，在一定条件下会发生水解反应产生没食子酸。β-PGG 具有多重生物学及药理学活性，如抗炎，抗氧化，抗癌，抗肿瘤，抗血管再生及延长寿命[4-10]等。近期研究发现β-PGG 在预防及治疗糖尿病方面具有较高的价值，成为国内外近几年研究热点。β-PGG 在降低血糖方面的作用机理如下：模拟胰岛素，促进葡萄糖转运[11]、抑制磷酸烯醇式丙酮酸羟激酶(PEPCK)基因表达[12]、缓解胰岛素抵抗[13-17]、抑制α-葡萄糖苷酶[18-19]及 11β羟类固醇脱氢酶 1 型（11-β-HSD-1）活性[20-21]。β-PGG 抑制岛β细胞凋亡机理如下：抑制胰岛淀粉样多肽（IAPP）的沉积[22]、抑制胰腺星状细胞诱导β细胞凋亡[23-25]。此外，β-PGG 对糖尿病血管病变、神经病变、糖尿病肾病等糖尿病并发症也具有一定的防治作用。
硫氧还蛋白相互作用蛋白及硫氧还蛋白近期研究进展
近期研究提示：⑴. TXNIP 通过增加氧化应激程度，并且抑制 Trx1的表达，诱导胰岛β细胞凋亡。高糖状态下，TXNIP 表达与葡萄糖浓度存在递增效应关系，同时 TXNIP 表达增强可使细胞内 ROS 水平增高，敲除 TXNIP 基因能够增加 Trx1 活性，使细胞内 ROS 水平减低，在高糖促 TXNIP 表达增强的情况下，可以导致氧化应激程度加重[26]。过表达 TXNIP 可以激活诱导型一氧化氮合成酶（iNOS）介导的细胞损伤。研究显示：TXNIP 是蛋白质的巯基-亚硝基化的内源性调节因子，TXNIP 可直接与 Trx1 的活性位点 Cys32 结合，抑制 Trx1介导的去亚硝基化，使 Trx1 抵抗亚硝化应激的效能下降[27]。(2). TXNIP 通过刺激相关信号通路的表达，诱导胰岛β细胞凋亡。Reich E 等[28]发现 TXNIP 可作为糖皮质激素诱导胰岛β细胞凋亡的新调节因子，在糖皮质激素刺激的胰岛β细胞中TXNIP 被 MAPK 激活。另外，Akt/Bcl-xL 是胰岛β细胞存活的非常重要的信号体系，Akt 信号途径有助于维持胰岛β细胞的存活，而且 Bcl-xL 是抗凋亡因子，可保护线粒体膜的完整性，增加 Akt 的表达及活性，从而抑制胰岛β细胞凋亡[30]。TXNIP 缺失时 Akt/Bcl-xL 表达增加，胰岛细胞中抗凋亡和促存活的途径被激活[29]，使在 STZ 作用下胰岛β细胞的存活力增强。
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第一章 连续腹腔注射β-PGG后对STZ诱导糖尿病模型大鼠的影响
第一节 HPLC 法测定连续性腹腔注射β-PGG 后血液及胰腺中β-PGG 及没食子酸的浓度变化1.材料与方法
1.1 仪器
（1）高效液相色谱仪 美国 Agilent 公司
（2）超声波细胞破碎仪 日本 HITACHI 公司
（3）高速低温离心机 日本 HITACHI 公司
（4）4℃冰箱 海尔集团
1.2 试剂
（1）β-PGG 标准品 (由成都普瑞法科技开发有限公司提取在五倍子中提取的单体化合物，其纯度在 98%以上，批号：14021908）
（2）没食子酸标准品 (购自云南昆明中检所，批号：110831-201204）
（3）链佐脲菌素（Streptozocin,STZ）(购自 sigma 公司）
（4）甲醇（色谱纯）（购自天津市志远化学试剂有限公司）
（5）乙腈（色谱纯）（购自天津市志远化学试剂有限公司）
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2.结果及分析
2.1 线性关系考察结果
根据 1.7.1 测定的β-PGG 的峰面积，以β-PGG 的峰面积为纵坐标（Y），以β-PGG 标准品的进样质量为横坐标（X），建立线性回归方程：y=2482.0x-215.21，r=0.9996，线性范围为 3.38μg-5.46 μg。结果表明：β-PGG 峰面积与其质量有良好的线性关系。
根据 1.7.2 测定的没食子酸的峰面积，以没食子酸的峰面积为纵坐标（Y），以没食子酸标准品的进样质量为横坐标（X），建立线性回归方程：y=1308.1x+8.2901，r=1.0,线性范围为 0.18μg-0.66μg。结果表明：没食子酸峰面积与其质量有良好的线性关系。
2.2 精密度实验结果
根据 5 次精密度实验，得到了不同β-PGG 的峰面积（表 1），β-PGG 的峰面积平均值为 11875.1，RSD 值为 1.31%，表明该方法精密度良好。
根据 5 次精密度实验，得到了不同没食子酸的峰面积（表 2），没食子酸的峰面积平均值为 3289.4，RSD 值为 0.76%，表明该方法精密度良好。
HPLC 法测定β-PGG 对照品，其色谱峰良好（图 1）。在空白组大鼠与模型组大鼠的血清样本中未检测出β-PGG。在 10mg PGG 组、20mg PGG 组、30mg PGG组、10mg PGG+STZ 组、20mg PGG+STZ 组、30mg PGG+STZ 组中均检测出β-PGG，且色谱峰良好（图 2）。20mg PGG+STZ 组的β-PGG 浓度高于 20mg PGG组，并有统计学差异（P＜0.05）。其他组比较无统计学差异（P＞0.05）（图 3）。
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第二章 HPLC 法测定一次性腔注射β-PGG 后血液及胰腺中β-PGG 及没食子酸的浓度的实验.....31
1. 材料与方法.............................................31
1.1 仪器...................................................31
1.2 试剂..................................................31
1.3 实验分组及给药........................................31
1.4 组织样本处理.............................................32
1.5 标准品溶液的制备 .....................................32
1.6 β-PGG 及没食子酸测定方法............................ 32
实验讨论..................................................39
总结与展望............................................43
实验讨论.
HPLC 法测定连续性腔注射β-PGG 后血液及胰腺中β-PGG 及没食子酸的浓度的实验讨论
正常大鼠及 STZ 诱导糖尿病大鼠腹腔注射β-PGG 后，在其血清及胰腺中均可测出β-PGG，并且在胰腺中检测出没食子酸；STZ 诱导的糖尿病大鼠胰腺中没食子酸的浓度明显高于正常大鼠胰腺中的浓度，且均有统计学差异（P＜0.05）（图 8）；在 STZ 组中腹腔注射 20mg/kg 的β-PGG 大鼠血清中β-PGG 的浓度低于空白组中腹腔注射 20mg/kg 的β-PGG，并有统计学差异（P＜0.05）（图 3）。
本试验的结果提示：β-PGG 在一定条件下可以分解出没食子酸；在胰腺中测定的结果推测：β-PGG 在胰腺组织中较血液中更容易受到酸碱的影响而使β-PGG分解出没食子酸；健康的机体内，血液的 pH 值在 6.4 与 7.34 之间的范围[31]，而胰腺组织的 pH 值为 4.5[32]；可能由于胰腺中 pH 较血液中低，导致β-PGG 进入胰腺后较在血液中更容分解出没食子酸。
腹腔注射β-PGG 后，STZ 诱导的糖尿病大鼠胰腺中的没食子酸浓度较正常大鼠更高的现象提示：腹腔注射 STZ 诱导糖尿病大鼠后，胰腺微血管通透性可能变化，导致β-PGG 更容易进入胰腺中，并分解出没食子酸；STZ 诱导糖尿病大鼠模型是通过损伤胰岛β细胞改变其结构与功能而形成的[33-34]。STZ 与 GLUT2结合，切断葡萄糖进入胰岛β细胞、肾脏细胞及肝脏细胞的通道，导致胰岛素分泌减少，持续高血糖状态对胰腺、肾脏和肝脏产生损害[35]；此外，在 S.Sandler[36]等研究中发现 STZ 会增加糖尿病模型大鼠胰腺微血管的通透性。在前期实验中，我们将相同质量β-PGG 对照品放入 pH 为 2、3、4、5、6、7、8 的缓冲液中，水浴 2 小时。结果：β-PGG 在 pH 为 5 的缓冲液中浓度最低，分解出的没食子酸在pH 为 5 的缓冲液中浓度最高[37]。提示：β-PGG 在不同 pH 缓冲液中，当 pH 为 5时β-PGG 分解出没食子酸的量最多。在本实验中我们推测：STZ 诱导的糖尿病大鼠胰腺微血管通透性发生了改变使β-PGG 更容易进入胰腺中，而胰腺微血管通透性发生改变致使胰腺与血液的 pH 值发生了变化，酸碱度对β-PGG 的影响进而导致在STZ诱导的糖尿病大鼠胰腺中较正常大鼠胰腺中更容易分解出没食子酸。
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总结与展望
近几年世界范围内的糖尿病患病人数从 2013 年的 3.82 亿人增长至 2015 年的 4.15 亿人，国际糖尿病联盟（IDF）预测 2040 年全世界患糖尿病人数将达到6.42 亿人。发现新的可治疗糖尿病的天然活性产物仍具有较高的价值。利用 STZ 诱导建立糖尿病大鼠模型。通过 HPLC 法检测β-PGG 能够进入胰腺中，并且在胰腺中分解出没食子酸，考虑没食子酸可能对胰岛β细胞凋亡也有一定的作用。
通过 Western blotting 法测定结果提示：在糖尿病大鼠胰腺中，随着腹腔注射β-PGG 浓度的增加，TXNIP 的表达有下降的趋势，Trx1 的表达有上升的趋势，推测，β-PGG 可能具有抑制 TXNIP 表达，促进 Trx1 表达的作用，对胰岛β细胞具有一定的保护作用。对于腹腔注射β-PGG 后，糖尿病大鼠胰腺中分解出没食子酸的浓度明显高于正常大鼠胰腺中的浓度的机制有待更进一步的研究。此外，没食子酸是否具有防治糖尿病的作用需进一步研究。
本试验为进一步开发保护胰岛β细胞的药物，及寻找保护胰岛β细胞的天然活性产物提供一定参考。
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参考文献（略）