前 言
目前临床上主要应用抗流感的药物有两类：一类是神经氨酸酶抑制剂，一类是离子通道 M2 抑制剂，早期这两类药物均可有效缩短病程并减轻症状，但长期使用，病毒株容易产生耐药性。而抗病毒类中药具有调节多靶点的特点，对耐药性病毒仍具有潜在的治疗作用。因此，从传统清热解毒中药寻找出抗流感作用的药物一直是药学研究的热点。
人中黄为甘草的一种特殊炮制品，在《本草便读》、《本草备要》、《本草从新》等古籍文献中均有记载，具有清热、凉血、解毒等功效，并且对人中黄的用法、用量、临床运用等介绍比较详细，尤其是对瘟疫的治疗，人中黄疗效显著。如今，出于对药物安全和卫生的担忧，有学者提出淘汰人中黄、人中白、五灵脂等特殊类传统药物。笔者认为，对该特殊类药物盲目草率的一概废除的观点或做法欠妥。不论是从妊娠牝马的尿中分离出女性激素、从男性的尿液中提取到雄酮的史例，还是在当今的美国利用粪菌移植技术治疗疑难性肠道疾病的成功案例，无不提示我们应重视采用现代科学技术对该类传统药进行基础研究。
人中黄属于冷背药材，长期以来，由于其用量小，人中黄的生产没有形成规模化，也没有引起药品监管部门的重视，更没有完善的药材质量标准，药材掺假问题突出，药材质量和安全性堪忧。鉴于此，本论文对人中黄质量标准进行较系统研究，同时对人中黄体外抑菌、抗流感病毒活性进行初步研究，旨在为人中黄的物质基础研究奠定基础。
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第一章 人中黄质量控制研究
本文对人中黄的质量标准进行了较系统的研究，增加了微生物限度（控制菌）检查，采用 HPLC法建立了人中黄的指纹图谱，并建立了同时测定人中黄中甘草苷、甘草酸、甘草素三种指标成分含量的方法。
1.仪器与试药
1.1 仪器
实验用仪器见表 1-1。
1.2 菌种
枯草芽孢杆菌（CMCC 63501）株、大肠埃希菌(CMCC 44102)株、金黄色葡萄球菌(CMCC 26003)株、白色念珠菌(CMCC 98001)株、黑曲霉菌(CMCC 98003)株，由湖北省食品药品监督检验研究院提供。
1.3 试药
甘草药材：10 批，市售品，来源见表 1-2。经湖北中医药大学杨红兵教授鉴定，均为甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch）的干燥根及根茎。粉碎，过三号筛。备用。
人中黄样品：自制。取上述 10 批甘草粗粉，参照《中药大辞典》[2]记载的人中黄炮制方法制备而成，晒干，备用。分别编号为 S1~S10。
人中黄样品：市售品，来源见表 1-2。分别编号为 S11、S12。
对照物：甘草素对照品（编号 B20416，含量 98 %）、甘草酸单铵盐对照品（编号 P29M6R7，含量 98%）、甘草苷对照品（编号 Z01027BA14，含量 98%）均由上海源叶生物科技有限公司提供。
甲醇（色谱级）、乙醇（分析纯）、磷酸（分析纯），均由国药集团提供；乙腈（色谱级，TEDIA 公司）、其余试剂均为分析纯，水为重蒸水。
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2.性状
根据对 10 批人中黄样品性状观察，人中黄的性状可描述为：本品完整者呈圆柱形，长短不等。外表面及断面均呈暗黄色，稍粗糙，可见细小短节状的纤维纵横交织，外表面偶见附有灰黄色的膜状竹衣残片。质坚实，略硬，不易敲碎，但表面易剥落。气特异。
取样品，研细，置于载玻片上，加水合氯醛处理后，置显微镜下观察：纤维成束或散在，纤维束周围薄壁细胞含草酸钙方晶，形成晶纤维；具缘纹孔导管较大，稀有网纹导管；木栓细胞红棕色，多角形，微木化。
10 批自制人中黄样品的显微特征均与甘草的粉末特征相似。而 S11、S12 两批市售品样品中，上述显微特征难以察见，但可见较多的砂砾及其他植物性杂质，说明市售品药材掺伪严重。结果见表 1-3、图 1-1。
大肠埃希菌验证：试验组：取 1:10 供试液 10ml、大肠埃希菌 1ml 接种到同一 100ml 的胰酪大豆胨液体培养基，至 35～37℃ 培养 24h，依大肠埃希菌检测方法进行检查。阳性菌对照组：取大肠埃希菌液1ml至 100ml的胰酪大豆胨液体培养基中，方法同试验组进行检查。阴性对照组：取稀释液 10ml 至 100ml 的胰酪大豆胨液体培养基中，方法同试验组进行检查。
耐胆盐革兰阴性菌验证：试验组：取 1:10 供试液 1ml、大肠埃希菌1ml 加至 10ml 的胰酪大豆胨液体培养基试管中，至 35～37℃ 培养 24h，依耐胆盐革兰阴性菌检测方法进行检测。阳性对照组：取大肠埃希菌 1ml加入 10ml 胰酪大豆胨液体培养基试管中，方法同试验组进行检查。阴性对照组：另取 1 支胰酪大豆胨液体培养基加入稀释液 1ml，方法同试验组进行检查。
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第三章 人中黄体外抗流感病毒研究........................43
1 实验材料.............................................43
2 实验方法............................................46
3 结果..............................................48
4 讨论................................................57
结语与创新...........................................58
第三章 人中黄体外抗流感病毒研究
取 96 孔的 V 型微量血凝版，从左至右各孔加入 50μl 生理盐水，于左侧一孔加入 50μl 收获液，混合均匀后，吸 50μl 至第二孔，混合均匀后，吸 50μl 至第 3 孔，依次倍比稀释至第 12 孔，吸弃 50μl，最终病毒稀释度为 1:2、1:4、1:8、...、1:4096，重复 3 次，最后一排为生理盐水对照组。稀释完毕后每孔加入 1%鸡红细胞 50μl 置恒速摇床振荡 1min，使血球与病毒充分混合，室温放置 30-40min 后，观察结果。判定结果：“++++”表示红细胞全部凝集； “+++”红细胞凝集基本同上，但孔底有大圈；“++”红细胞于孔底形成中等大的圈，四周有小凝块；“+”红细胞于孔底形成小圆点，四周有少许凝集块；“-”红细胞于孔底形成小圆点，边缘光滑，红细胞完全不凝集。
取 MDCK 单层细胞一瓶，弃去生长液，加入 0.25%胰酶 1ml，37℃消化至细胞变圆回缩，加入 10%胎牛血清的 DMEM 培养基调整细胞浓度为 2×105个/ml，用加样器向 96 孔细胞培养板每孔加入细胞悬液 100μl。将 96 孔细胞培养板置 37℃、5%CO2培养箱中培养 24h，细胞快速生长，形成 70%左右单层可用于病毒接种。将病毒用维持液进行 10 倍稀释，稀释至七个不同的浓度，用 15μg/ml 胰酶预处理后，接种于 MDCK 细胞上,每孔接种 100μl。将病毒感染后的细胞板置温箱吸附 2h 后，弃去病毒稀释液，用 PBS 清洗细胞两到三次后，每孔加入 100μl 病毒生长液，同时设置细胞对照，每个浓度重复 4 孔，置 37℃、5%CO2培养箱继续培养，用倒置显微镜观察细胞病变，观察 72h，用 MTT 法对活细胞进行染色，测吸光度 A570值，根据 A 值计算不同药物浓度下细胞存活率。用Reed-Muench 公式计算病毒液的半数感染浓度(TCID50)。
用细胞维持液将人中黄不同提取物、甘草总提取物、利巴韦林递倍稀释成不同浓度的含药维持液，加入已长成单层的 MDCK 细胞 96 孔板中，每个稀释度重复 5 孔，每孔 200μl，同时设正常细胞对照孔。置 37℃、5%CO2温箱培养，每天观察细胞形态变化，72h 后，用 MTT 法对活细胞进行染色，测吸光度 A570值，根据 A 值计算不同药物浓度下细胞存活率。用 Probit 回归计算药物半数中毒浓度（TC50），并算出药物安全浓度（无明显细胞毒性，存活率大于 80%）。
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结语与创新
人中黄为甘草的一种特殊炮制品，具有清热、凉血、解毒等功效，在《本草便读》、《本草备要》、《本草从新》等古籍文献中均有记载，并且对其用法、用量、临床运用等介绍比较详细，尤其是对瘟疫的治疗方面，人中黄疗效显著。而人中黄属于冷背药，没有引起药品监管部门的重视，药材掺假问题突出，药材质量和安全性堪忧。鉴于此，本论文对人中黄质量标准进行研究，同时对人中黄及其不同极性提取物的体外抑菌、抗流感病毒活性进行初步筛选。本论文的创新之处体现在以下点：
1.首次对人中黄进行了较系统的质量标准研宄，建立了较完善的质控标准。采用 HPLC 法建立人中黄的指纹图谱,同时测定人中黄中甘草苷、甘草素和甘草酸三种成分的含量,为更好地控制人中黄的药材质量、研究人中黄的物质基础奠定了良好的基础。
2.本课题首次对人中黄体外抑菌实验进行研究，采用纸片扩散法和二倍稀释法，考察了人中黄总提取物对实验菌的抑制作用，结果表明人中黄具有一定的抑菌作用，并且对金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的抑制作用较强。
3.本课题首次对人中黄体外抗流感进行研究，采用 MTT 法观察其抗流感病毒的活性部位。结果表明，人中黄总提取物、甘草总提取物、正丁醇部位、水部位和利巴韦林组（阳性对照组）均有抗流感病毒生物合成作用；正丁醇部位直接具有杀灭病毒的作用，且与利巴韦林组对无显著性差别。为中医临床治疗瘟疫提供了科学依据。
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参考文献（略）