引言
杜仲CEwcomm/fl ulmoides OHv.)为杜仲科杜仲属落叶乔木，在我国主要分布在秦岭以南华中地区的四川、贵州、湖南、湖北、陕西等省[1]。其皮、叶作为中药材，均有补肝肾，强筋骨之功效⑴。研究表明杜仲中含有的环烯醚萜类、木脂素类、苯丙素类、黄酮类化学成分具有调节血压作用，其中桃叶珊瑚苷有较强的护肝作用，绿原酸具有明显的抗菌活性[3]除较高的药用价值外，杜仲在经济上的开发前景极大，在食品、保健品、医疗、通讯设备等行业运用广泛。此外，作为目前杜仲科杜仲属仅存的孑遗植物，杜仲对于研究我国植物起源和被子植物演变等方面都具有非常重要的参考价值。尽管近年来我国杜仲引种栽培，资源不断扩大，野生资源仍在不断减少，这就意味着孑遗树种杜仲在栽培过程中会出现种源变异和质量退化等现象。另外，由于杜仲植物地理分布广，形体变异大，药材品质差异也大。因此对杜仲种质资源的遗传多态性进行评估及保护工作，推广杜仲遗传优良品种的引种培育，对避免盲目的引种以及杜仲物种的演化发展具有极其重要的意义。
一个物种对环境适应能力的强弱取决于该物种种内的遗传多态性或遗传变异[31]，因此对生物遗传多态性及其亲缘关系的分析是保护生物多态性、探讨物种进化机制以及遗传资源利用的前提。运用快速可靠的手段对种质资源进行遗传多态性分析，明确其遗传距离，获得亲缘关系对于物种的遗传学研究、种质资源的幵发利用及改良均有重要意义。微卫星DNA (SSR)因其所具有的多态性高、共显性、易检测、重复性好等优点，己成为居群遗传多态性研究中有效的分子标记之一。与传统基因组SSR相比，表达序列标签-简单重复序列（EST-SSR)具有基因组SSR优点的同时标记又与功能基因相关联，开发意义更大，在中药种质资源评估及分子辅助育种等方面更具优势。但目前关于杜仲种质资源的遗传基础研究相对薄弱，缺乏遗传领域的知识积累，因此有必要开展杜仲微卫星标记的遗传多态性研究，为构建我国杜仲种质资源的SSR基因型数据库奠定方法学基础。
本研究拟利用微卫星标记技术对不同地域来源的杜仲进行遗传多态性研究，探讨杜仲主要产地的遗传结构及亲缘关系。同时对不同产地杜仲叶的活性成分含量进行测定，从遗传差异和药材品质上对不同产地杜仲共同进行评估。研究结果可为杜仲的种质资源的分类和利用提供遗传水平的依据，为其分子辅助育种奠定基础，对保护药用植物生物多样性，推动中药资源可持续发展以及大宗中药材的综合开发利用有着重要作用。
第一章杜仲试验样品采集及SSR-PCR反应体系的建立
1材料
1.1不同产地样品采集
查阅相关文献资料收集杜仲资源分布、生态环境、采收等信息，以此拟定了湖南、贵州、陕西、重庆四个省市的杜仲生长地作为样品采集地区，其中以湖南省作为重点。采集10年左右树龄的杜仲叶片为材料，作为当地种源的代表，每株采集高度保证生态位基本一致，记录采集地经炜度、海拔高度、主要形态等信息。样品取无病虫害、健壮的杜仲嫩叶，桂胶快速干燥保存，移至实验室保存于-80℃冰箱中备用。样品信息见表1.1。
1.2仪器
BioPhotometer plus型核酸蛋白仪（Eppendorf公司），MyGene L96型PCR扩增仪（杭州朗基科学仪器有限公司），EPS-300型电泳仪（上海天能科技有限公司），VE-180型垂直电泳槽（上海天能科技有限公司），GIS-1000B型凝胶成像系统（上海天能科技有限公司）。
1.3试药
TaqrDNA聚合酶、dNTP Mixture、MgCh试剂、10X PCR Buffer购自TaKaRa公司；XDNA/Hind ffi购自北京天根生物科技有限公司；100 bpphis DNA Ladder、30% Acrylamide-Bis购自北京索莱宝科技有限公司；Gelred突光染料（美国Biotium公司）购自上海开放生物技术有限公司。引物是从NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)网站下载的EST (表达序列标签）序列经Primer 3等生物信息学软件设计而来，再经上海生工生物技术有限公司合成，编号为C93、C115，引物序列见表1.2。
2方法与结果
2.1杜仲叶基因组DNA的提取
由图1.3可知，这6个DNA用量水平均能扩增出较清晰稳定的特异性条带，之间影响差异均不显著。在DNA用量为lOng时，扩增谱带亮度相对较弱。结果说明模板DNA适宜的用量范围较宽，对PCR扩增结果影响不明显。考虑节约实验成本，将正交试验的模板用量水平分别设定为30，40，50和 60 ng。
利用最终确立的优化反应体系，对引物C93的退化温度进行梯度检测，设置退火温度范围46-60。C，PCR扩增仪自动生成46.0，46.3，47.4,48.8, 50.4，52.1, 53.8, 55.5，57.2, 58.6, 59.6, 60.0 °C12个温度梯度进行试验。由图1.8可知，随着退火温度的降低，PCR扩增的目的条带亮度增强的同时，非特异性条带也逐渐增多。退火温度在60 'C时，条带清晰，非特异性条带干扰少，故引物C93的退火温度确定为60 °C。
到目前为止已有许多其它不同物种SSR-PCR体系的研究但绝大多数研究者采用单因素试验法，不仅无法顾忌到各因素间可能存在的交互作用，而且试验次数也较多。如Mg2+在反应体系中决定了 Tag DNA聚合酶活性及DNA稳定性的同时，还会结合体系中引物，dNTP及DNA模板，从而影响其他因素的作用[26]。若单独采用正交试验设计对体系进行优化，则必须考虑各影响因素水平设计范围的合理性、试验结果评价的客观性等问题。故本文结合单因素试验和正交试验优化反应体系。本文实验运用了2对微卫星引物对6份不同产区的杜仲样本进行验证试验，结果发现重庆秀山产地的杜仲样本对引物C93的扩增表现出杂合基因型，对引物C115的扩增则表现出纯合基因型，与其他地区的杜仲样本扩增结果不同。初步揭示了不同产地杜仲资源的遗传差异，展现了 SSR标记在杜仲遗传多态性及亲缘关系等研究领域的优越性。
第三章不同产地杜仲叶活性成分含量研究............24
1材料....................................24
1.1 仪器....................................24
2方法与结果....................................25
2.1 色谱条件....................................25
2.2样品溶液的制备....................................25
2.3方法学验证....................................26
2.4样品含量测定....................................30
2.5聚类分析....................................33
3分析与讨论....................................34
3.1提取方法及溶剂的选择........................34
第四章总结与展望....................................36
1总结....................................36
2展望....................................37
第三章不同产地杜仲叶活性成分含量研究
3分析与讨论
3.1提取方法及溶剂的选择
实验前期比较了超声和回流两种提取方法，对杜仲叶中桃叶珊糊昔等活性成分含量的影响。结果发现，两种方法的提取效率差别不大。考虑到超声提取方法较简捷，因此选用超声提取。由于桃叶珊糊苷、京尼平苷酸、绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷均可溶于甲醇，提取溶剂分别采用25%、50%、75%、100% 4种不同浓度的甲醇对杜仲叶进行提取。结果发现，50%的甲醇提取效果最好，色谱图中各峰的分离度也较好，故选用50%甲醇作提取剂。
3.2色谱条件的确定
查阅相关文献[38]，杜仲活性成分桃叶珊湖苗有末端吸收，绿原酸、京尼平苦酸、松脂醇二葡萄糖哲、产丁的检测波长分别是327 nm、254nm、277nm、360nm 左右。实验选择 210 nm、254 nm、277 nm、327nm、360nin 5个波长进行比较测定。结果表明，波长检测为210nm时，桃叶珊糊苷吸收值最大，绿原酸等活性成分吸收值也较大，且分离度良好，故选用210nin为检测波长。由于绿原酸和京尼平苷酸化学结构中含有羧基，所以考虑在流动相中加酸以改善峰形。实验前期比较了乙腈-0.1%磷酸水、乙睛-0.1%醋酸水、甲醇-0.1%磷酸水、甲醇-0.1%醋酸水四种体系，结果发现，乙腈-0.1%磷酸水分离效果最好。
3.3含量测定结果分析
药用植物大部分活性成分是植物的次生代谢产物，而次生代谢产物在植物体内的合成与积累是药用植物在一定环境下长期生存选择的结果，本研究分析了不同产地杜仲叶中主要活性成分的含量差异，并以此对不同产地杜仲进行了聚类分析。在所测样品中，绿原酸含量均达到《中药药典》（2010版）标准，绿原酸〉0.08%。贵州遵义和重庆秀山两产地聚为一类，质量最佳，湖南慈利、石门、桑植三个产地次之，陕西略阳另聚为一类。
第四章总结与展望
1总结
杜仲作为我国特有的名贵树种，不论是在药用方面还是经济价值上，都具有相当大的应用前景。作为拥有全球绝大多数杜仲资源的国家，我们要保护7遗树种遗传多态性的同时，大力开发已有的杜仲资源。本论文运用分子标记技术对不同产区的杜仲种质材料进行了遗传多态性及亲缘关系研究，同时对不同产地杜仲的活性成分含量进行了测定，从遗传差异和药材品质两个方面评价杜仲资源。通过研究杜仲分子水平的遗传变异，为杜仲的分类及育种等提供可靠的分子水平的科学依据，为挖掘优良杜仲基因资源和核心种质资源的筛选与保存提供数据。主要研究结果如下：
利用微卫星分子标记技术对杜仲群体遗传多态性及亲缘关系进行研究。筛选得到的18对引物共扩增出74条清晰带。Nei's基因多样性指数H=0.3750，Shannon's多态性信息指数1=0.5512。基因分化系数Gst=0.1149。湖南石门与桑植之间有一定的亲缘关系，重庆秀山与陕西略阳之间遗传距离最大。杜仲居群内遗传多态性丰富，而不同产区间的遗传多态性低，不同产地之间存在较大基因流。
杜仲遗传差异与活性成分含量的聚类结果中，重庆秀山与陕西略阳两产地间不论是遗传距离还是活性成分含量差异都是最大。杜仲有效成分含量的差异受内在遗传和外部环境的共同作用，因此还需要通过解析遗传和环境因子的关系，进一步探讨遗传差异和环境因素对杜仲活性成分的影响。
2展望
随着中药材需求逐年增加，优质和充足的药材资源是保障中药材市场乃至整个中医药事业良好、有序发展的前提。DNA分子遗传标记技术的运用为中药材特别是对大宗药材及资源紧缺品种在遗传学、生态学、基因改良等研究领域提供了新的技术平台。SSR分子标记技术作为其中—种较为快捷、简单、稳定的有力手段，我们应积极拓宽SSR标记技术在药物植物研究上的应用种类和深度，尤其是在药用植物种质资源遗传多态性研究以及抗病虫害等遗传育种研究等方面，可以借鉴微卫星标记在其他物种上应用的成功经验，相信一定能够加速药物植物的良种化进程，在深度和广度上辅助药用植物研究与开发利用，促进中药现代化。
参考文献（略）