前 言
1.聚酰胺-胺树状大分子的研究进展
近年来，肿瘤的化学治疗已经取得了重大的进展，尤其是在抗肿瘤药物的聚合物递释系统方面的研究，已经越来越受到研究者的重视，成为国内外的研究热点之一[1, 2]。在这些聚合物递释系统中，聚酰胺-胺树枝状大分子（Polyamidoaminedendrimer，PAMAM）是近二十年来发展起来的具有树枝状骨架和球状外形的纳米级聚合物，因其具有独一无二的结构特性而受到广泛的关注。PAMAM 最早是由美国化学家 Tomalia 博士于 1984 年合成成功的，并在 1990 年实现了商品化[3, 4]。PAMAM 树状大分子的合成一般采用发散法，经重复的逐级聚合反应，围绕中心核向四周径向生长、加层，最终形成树枝状结构。每循环一次就在已形成的聚合物上添加一层（一代），并且其相对分子质量呈指数增大，直径按约 1 nm 的量数增加[5, 6]。PAMAM 的结构如图 1 所示，主要包括三个部分：初始核（氨或乙二胺等）、枝（代数）和末端基团[7]。相对于其它的聚合物载体材料，PAMAM 具有自己独特的结构特征：首先，其内部具有疏水性的空腔，可以包裹疏水性的药物分子，如阿霉素、紫杉醇等；其次，其末端有许多反应活性较强的氨基，通过修饰不仅可以连接多肽或抗体等生物活性物质，而且还可以通过酸敏感或还原敏感的化学键连接药物分子；此外，PAMAM 还具有稳定、无免疫原性和良好的生物相容性等优点[4, 8-10]。这些独特的结构特征使其在生物医药领域得到了广泛应用，如作为基因载体、药物载体、磁共振成像对比剂等[11-14]。
1.1 PAMAM 作为基因载体的研究
1993 年，Haensler 等人首次报道了 PAMAM树形分子能将 DNA 高效转染到不同的哺乳动物细胞中，其转染效率主要取决于树形分子与 DNA 比例及树形分子的大小[20]。此外，PAMAM 表面带有的大量氨基还可共价偶联一些配体，从而可通过配体-受体介导的细胞内吞作用来提高复合物在特定细胞中的转染效率。而进入细胞后，在溶酶体的酸性环境中，PAMAM 表面的氨基发生质子化，产生“质子海绵效应”[21-23]，造成溶酶体的膨胀和破裂，从而有效的释放基因物质到细胞质中。
1.2 PAMAM 作为药物载体的研究
树状大分子作为药物载体也是生物医学领域的研究热点之一，树状大分子具有强大的包容空间和大量的末端功能基团，可以与许多药物作用，达到增溶、增效、缓释和控释的目的，能够有效降低药物的不良反应，提高其治疗指数[24, 25]。此外，通过化学键偶联抗体、核酸适体和多肽等生物分子还可制备具有靶向功能的药物传递系统，实现对目标组织和细胞的靶向治疗[26-28]。树状大分子和药物作用的方式主要有两种：即物理包载和化学键合。1999 年，Malik 等人首先用 3.5 代的 PAMAM来包载抗肿瘤药物顺铂，结果发现修饰后的复合物显示出较高的水溶性和缓释作用，并且表现出更强的抗肿瘤活性，且毒性要比顺氯氨铂低 3-5 倍[29]。类似地，Balogh等人用 PAMAM 来包载抗菌药银盐，结果显示该复合物同样表现出缓释作用，并对多种革兰氏阳性菌有很强的抗菌作用[30]。Kojima 等人合成了聚乙二醇接枝的PAMAM 树状大分子，不仅保留了其疏水性的内部空间，而且还增强了树状大分子的生物相溶性。用其包裹抗癌药阿霉素和甲氨喋呤（图 2），结果显示 PAMAM 的载药性能随其代数和表面连接的聚乙二醇链长度的增加而增加。当 G4 代的 PAMAM连接 PEG2000时，其载药量最高，平均每个 PAMAM 分子能包载 6.5 个阿霉素和 26个甲氨喋呤分子，而且其包载的药物具有很好的缓释效果，在低离子强度的水溶液中释放缓慢，而在等渗溶液中迅速释放[31]。此外，Bhadra等人合成了以羧甲基PEG5000修饰的 PAMAM到肿瘤部位后，其表面连接的可剪切的 PEG 链在半胱氨酸的刺激下发生断裂，暴露出其表面修饰的靶向配体并与肿瘤细胞表面高表达的受体特异性的结合，从而实现主动靶向的功能。与普通的脂质体相比，该还原刺激响应的脂质体能显著增加肿瘤细胞的摄取，从而更好的发挥抗肿瘤作用。
2. 还原敏感纳米载药系统的研究进展
在近十几年里，还原敏感的生物可降解聚合物作为一类可用于药物控制释放的载药材料而日益受到人们的重视。这些材料通常在主链，侧链或交联剂中含有二硫键。二硫键在体内循环和细胞外的环境中非常稳定，但在细胞内的还原性化合物谷胱甘肽（GSH）的作用下，通过巯基-二硫键交换反应在几小时和数分钟内迅速解离[46, 47]。谷胱甘肽（GSH）是细胞中含量最高的巯基化合物，同时也是生物化学反应中的一种重要还原剂。细胞内的胞浆中含有大量高浓度的 GSH，通常为 2-10 mM，而在血液中仅存在少量低浓度的 GSH（2-10 μM）[48-52]。此外，肿瘤组织中的 GSH浓度是正常细胞和组织的 4 倍[53, 54]。这种 GSH 浓度的巨大差异，使得还原敏感的载药系统用于肿瘤部位的靶向药物释放成为了可能。Jreome 等人利用聚己内酯（PCL）和聚环氧乙烷（PEO）构建了还原敏感的聚合物胶束，该胶束能在血液中稳定存在，但在肿瘤细胞的还原环境中迅速聚集，从而起到了靶向药物释放的目的[55]。Zhong课题组报道了一种生物可降解的聚乙二醇-聚己内酯嵌段共聚物胶束（PEG-SS-PCL）用于抗癌药物阿霉素的靶向释放（图 3）[56]。这种胶束在水中非常稳定，但在 10 mM二硫苏糖醇（DTT）的刺激下会迅速发生聚集，其原因是由于该胶束的 PEG 壳层与PCL 核部分是通过还原敏感的二硫键连接的。体外释放表明，该聚合物胶束在非还原条件下仅有 20%的药物被释放，而在类似于细胞内的细胞质和细胞核的还原条件下，阿霉素在 12 小时内就被全部定量的释放出来。细胞毒试验表明，这种通过二硫键连接的胶束的抗肿瘤作用要显著高于没有二硫键连接的胶束。Bellamkonda 等人报道了一种可被半胱氨酸（Cysteine）剪切的，由磷脂聚乙二醇材料组成的脂质体[57]，该脂质体在血液循环时能掩盖其表面修饰的靶向配体，防止被网状内皮系统（RES）识别而被清除，从而延长在体内的循环时间，增强 EPR 效应，实现对肿瘤的被动靶向作用。当脂质体达到肿瘤部位后，其表面连接的可剪切的 PEG 链在半胱氨酸的刺激下发生断裂，暴露出其表面修饰的靶向配体并与肿瘤细胞表面高表达的受体特异性的结合，从而实现主动靶向的功能。与普通的脂质体相比，该还原刺激响应的脂质体能显著增加肿瘤细胞的摄取，从而更好的发挥抗肿瘤作用。
第一章 PAMAM-SS-PEG 聚合物的合成及性质表征
聚酰胺-胺树状大分子（Polyamidoamine dendrimer，PAMAM）是目前研究和应用最广泛的一类树状大分子聚合物材料。由于具有结构稳定、无免疫原性、对生物活性物质转运效率高等优点，使 PAMAM 已成为药物递释系统中的研究热点之一。但由于高代数的PAMAM表现出浓度依赖性的细胞毒性和溶血毒性使其在临床上的应用受到限制。普通 PEG 化修饰虽然可以降低载药系统的毒性，延长血液中的滞留时间，增强被动靶向作用，但是经过 PEG 化后会降低药物的释放速率，从而影响其抗肿瘤作用的发挥。本研究为了解决 PAMAM 的细胞毒性和药物释放之间的矛盾，通过采用一种异型双功能交联剂 SPDP，将 HS-PEG5000-OCH3通过可剪切的二硫键连接在 PAMAM 的表面，合成了 PAMAM-SS-PEG 聚合物。该聚合物能在血液循环时保持稳定，药物缓慢释放；当被肿瘤细胞摄取后，在高浓度的 GSH 刺激下，二硫键发生断裂，导致 PEG 从 PAMAM 表明脱落，从而快速释放被包载的药物，达到治疗肿瘤的目的。本章合成了三种不同 PEG 化程度的 PAMAM-SS-PEG 聚合物，通过 TLC、1HNMR 和 FTIR 对聚合物进行了结构确证，并对聚合物的粒径和 Zeta 电位进行测定。此外，在体外对聚合物的还原敏感性、溶血毒性以及体外的长循环作用进行了考察。最后通过 RBITC 探针，考察了聚合物在胞内的转运情况。
1 材料与仪器
1.1 材料
4 代聚酰胺-胺树枝状聚合物（PAMAM，西格玛奥德里奇上海贸易有限公司）；HS-PEG5000-OCH3（上海炎怡生物有限公司）；NHS-PEG5000-OCH3（北京键凯科技有限公司）；3-(2-吡啶二巯基)丙酸 N-羟基琥珀酰亚胺酯（SPDP, 圣克鲁斯生物技术上海有限公司）；还原谷胱甘肽（GSH，国药集团化学试剂有限公司）；透析袋（MWCO= 8000-14000，上海源叶生物科技有限公司）；薄层层析硅胶板（青岛海洋化工厂）；Sephadex G50（美国 GE Healthcare 公司）；胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司）；DMEM 细胞培养基（Gibco 公司）；青霉素-链霉素溶液、胰酶细胞消化液（碧云天生物技术研究所）
1.2 仪器
集热式磁力搅拌器（DF-101S，上海予正仪器设备有限公司）；旋转蒸发仪（RV10，德国 IKA 公司）；电子分析天平（EL104，美国梅特勒-托利多仪器公司）；台式离心机（TGL-16G，上海安亭科学仪器厂）；真空冷冻干燥机（FreeZone，美国 LABCONCO公司）；激光纳米粒度/电位仪（Nicomp TM 380 ZLS，美国Nicomp公司）；pH计（FE-20，美国梅特勒-托利多仪器公司）；水浴恒温振荡器（SHA-C，金坛市精达仪器有限公司）；超导核磁共振谱仪（Unity Inova 400M，美国瓦里安公司）；红外分光光度计（ProStar LC240，美国瓦里安公司）；超净工作台（SW-CJ-2D，苏州净化设备有限公司）
2 实验方法
2.1 PAMAM-SS-PEG 聚合物的合成
以 4 代聚酰胺-胺树枝状聚合物（PAMAM）、3-（2-吡啶二巯基）丙酸 N-羟基琥珀酰亚胺酯（SPDP）和 HS-PEG5000-OCH3为起始材料合成 PAMAM-SS-PEG（PSSP）聚合物，反应路线如图 1-1 所示[35, 84]。精密称取一定量的 SPDP 和 PAMAM，分别按两者的反应摩尔比为 8:1、16:1 和 32:1 溶于甲醇溶液中，加入少量三乙胺，氮气保护，在 30°C 黑暗环境中搅拌 5 h，然后加入一定量的 HS-PEG5000-OCH3搅拌 24 h后, 将反应混合物转移至 Sephadex G 50 凝胶色谱中（分离范围：1000-30000 Da），以蒸馏水为流动相，TLC 检测至无游离 PEG 流出后（展开剂：CHCl3/MeOH = 4:1，碘蒸汽显色），将所需产物的流出液收集，冷冻干燥得白色固体粉末即为PAMAM-SS-PEG 聚合物，三种反应摩尔比的产物分别称为 PSSP8、PSSP16、PSSP32，其产率分别为 75.7%、71.6%和 70.2%。
作为对照组，以 PAMAM 和 MeO-PEG5000-NHS 为起始材料合成 PAMAM-PEG（PP）聚合物。参考文献[34]，精密称取一定量的 MeO-PEG5000-NHS 和 PAMAM，按照反应摩尔比 8:1、16:1 和 32:1 溶于磷酸盐缓冲液（0.1 M，pH 8.0）中，氮气保护，在 30°C 黑暗环境中搅拌 24 h 后，将反应混合物转移至 Sephadex G 50 凝胶色谱中（分离范围：1000-30000 Da），以蒸馏水为流动相，TLC 检测至无游离 PEG 流出后（展开剂：CHCl3/MeOH = 4:1，碘蒸汽显色），将所需产物的流出液收集，冷冻干燥得白色固体粉末即为 PAMAAM-PEG 聚合物，三种反应摩尔比的产物分别称为PP8、PP16 和 PP32，其产率分别为 84.3%、79.2%和 76.5%。
采用不同浓度的谷胱甘肽（GSH）来考察聚合物的还原敏感性。取适量的三种不同比例的 PSSP 聚合物，分别加入浓度为 10 μM 和 10 mM 的 GSH（pH = 7.4）溶液，并转移至转速为 120 rpm，温度为 37°C 的恒温摇床中，分别于 0、15、30、45、60 min测定各样品的 Zeta 电位和粒径的变化，样品浓度为 1.0 mg/mL，每种样品平行操作三份。
取无菌新西兰白兔血 2 mL，于 1500 rpm 离心 5 min 沉淀红细胞，弃去上清液并用生理盐水洗涤沉淀的红细胞 3-4 次，至上清液不显红色为止[85]。将所得的红细胞用生理盐水稀释为 2% （v/v）的混悬液（当日使用，用时摇匀）。取 PAMAM、PSSP8、PSSP16 和 PSSP32 分别用生理盐水配制成一系列不同浓度的溶液（100-1000μg/mL），取 0.5 mL 溶液于离心管中，加入等体积 2%的红细胞混悬液混匀，于 37°C水浴中孵育1 h。另取2%的红细胞混悬液0.5 mL，加入等体积的蒸馏水和生理盐水，分别作为阳性对照和阴性对照。各试管以 5000 rpm 离心 5 min，吸取上清液移入比色皿中，紫外分光光度计于 570 nm 处测定吸收值，按下式计算溶血率。
第三章 PAMAM-SS-PEG/DOX 体内外抗肿瘤活性及其机制研究 ...........41
1 材料与仪器..............................................41
1.1 材料.....................................................41
1.2 仪器.......................................................41
第四章 RGD-PEG-SS-PAMAM/DOX 体内外抗肿瘤作用研究..............61
1 材料与仪器..................................................62
1.1 材料......................................................62
1.2 仪器.....................................................62
1.3 细胞.......................................................62
总结与展望......................................................84
1 全文总结...................................................84
2 研究展望......................................................85
2.1 本研究的创新点............................................85
2.2 工作不足与展望..............................................86
第四章 RGD-PEG-SS-PAMAM/DOX 体内外抗肿瘤作用研究
在前期的研究中发现，PSSP/DOX 复合物能显著地提高 DOX 的抗肿瘤作用，并能有效降低 DOX 对小鼠的毒副作用。但是，经过 PEG 化后的 PSSP 聚合物在一定程度上会降低肿瘤细胞的摄取，导致靶向作用减弱，影响其抗肿瘤效果。为了提高聚合物的靶向效率，增加聚合物的摄取量，目前研究最常用的方法是在 PSSP 的表面连接上能与肿瘤细胞内特定受体结合的配体，从而实现主动靶向和被动靶向相结合，最大程度的提高聚合物的靶向效率。
整合素 αvβ3 是一种非常重要的细胞黏附分子，是由 αv 链和 β3 链两个亚基形成的二聚体糖蛋白。研究表明 αvβ3 整合素在成熟的血管内皮细胞和大多数正常组织中表达缺乏或者仅少量表达，而在多种肿瘤细胞和新生血管内皮细胞中过度表达。肿瘤新生血管在肿瘤的生长和转移过程中起着重要作用，没有新生血管生成，肿瘤的生长就不会超过 1-2 mm。因此，如果能将药物同时靶向肿瘤细胞和肿瘤新生血管，对两者都起到杀伤作用，那么这将无疑会大大的增强其抗肿瘤效果。
整合素 αvβ3 能与细胞外基质（ECM）中的多种成分如玻璃连接蛋白、纤维连接蛋白、血管假性血友病因子、骨桥接素等相互作用，其配体中均含有相同的识别序列，即 RGD 多肽序列，因此整合素 αvβ3 又称 RGD 依赖性整合素。RGD 是一种精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸的三肽结构（Arg-Gly-Asp，RGD），是整合素受体与细胞外基质配体或基膜成分配体相结合的识别位点。因此，本研究采用在 PSSP 的外端连接上能与肿瘤细胞表面和新生血管内皮细胞表面高表达的整合素 αvβ3 特异性结合的 RGD 多肽，从而实现主动靶向和被动靶向相结合，增加肿瘤细胞摄取的目的。
本章首先以 4 代 PAMAM、SPDP 和 HS-PEG5000-COOH 为原料来合成 PSSP 聚合 物 ， 然 后 通 过 cRGDyK 上 的 氨 基 和 PEG 上 的 羧 基 特 异 性 反 应 合 成RGD-PEG-SS-PAMAM 聚 合 物 ， 并 以 DOX 为 肿 瘤 模 型 药 物 制 备RGD-PAMAM-SS-PEG/DOX 复合物。此外，本章还对复合物的体内外抗肿瘤活性进行了研究。其中体外部分包括复合物体外释放行为考察、细胞毒性研究、细胞摄取及摄取机理研究。体内部分以 B16 荷瘤小鼠为肿瘤动物模型，考察了连接 RGD 靶头前后对小鼠抗肿瘤作用的影响，并对肿瘤和各组织病理切片进行了 HE 染色观察。
总结与展望
1 全文总结
本文针对肿瘤细胞特定的病理和生理学特点，通过高分子材料学、分子生物学、细胞生物学、药理学和药剂学等学科的交叉应用，构建了具长循环、主动靶向、还原敏感释药等功能于一体的 RGD-PSSP 聚合物载药系统。该载药系统以 PAMAM 聚合物为基础，通过二硫键将 PEG 连接在 PAMAM 的表面，一方面可以显著降低PAMAM 的溶血毒性，延长聚合物在血液中的循环时间；另一方面可以保证复合物在到达肿瘤细胞后，在细胞内酸性和还原环境中迅速释放其包载的药物，从而实现还原和 pH 双重敏感释药的目的。此外，为了增加肿瘤细胞对聚合物的摄取，增加聚合物的主动靶向作用，本研究对聚合物载药系统的表面进行了 RGD 修饰，通过RGD 与肿瘤细胞表面和肿瘤新生血管细胞表面高表达的 αvβ3 受体特异性的识别来促进细胞摄取，发挥其主动靶向作用，增加抗肿瘤效果；本文对三种聚合物的理化性质及体内外抗肿瘤效果进行了评价，并对其抗肿瘤作用机制进行了初步考察，得到以下主要结论：
采用功能化的 HS-PEG5000-COOH 偶联 RGD 和 PAMAM 合成 RGD-PSSP聚合物，并在此基础上制备了 RGD-PSSP/DOX 复合物，考察其体外释放。结果表明，DOX 从 RGD-PSSP/DOX 复合物中的释放行为具有明显的还原和 pH 敏感性，与 PSSP/DOX 复合物相比，连接上 RGD 后对释放无明显影响。
以人脐静脉内皮细胞 HUVEC 作为肿瘤新生血管内皮细胞模型，同时以B16 细胞作为肿瘤细胞模型，对 RGD-PSSP/DOX 复合物的细胞毒性、细胞摄取及摄取机理进行考察。结果显示，连接 RGD 后显著增加了 RGD-PSSP/DOX 复合物对两种细胞的细胞毒性。细胞摄取及摄取机理研究表明，RGD-PSSP/DOX 主要通过RGD 多肽与细胞表面高表达的整合素 αvβ3 受体的特异性相互识别来与细胞接触，然后通过网格蛋白介导的内吞和细胞膜穴样内陷介导的内吞两种方式被细胞摄取。
2 研究展望
2.1 本研究的创新点
（1）本文将亲水性的 PEG 通过还原敏感的二硫键连接在 PAMAM 表面，同时将 cRGDyK 连接在 PEG 的另一端，构建了 RGD-PSSP 多功能聚合物载药系统，用于 DOX 的胞内传递，此研究工作未见国内外相关文献报道。
（2）通过多种抑制剂的抑制作用及细胞内药物分布定位观察等手段，首次阐明了 RGD-PSSP/DOX 复合物的肿瘤细胞内吞机制及 DOX 在细胞内的分布情况，揭示了其抗肿瘤作用的内在原因和机制，具有较强的创新性。此外，构建了 B16 荷瘤小鼠动物模型，首次在动物水平评价了 RGD-PSSP/DOX 复合物的抗肿瘤效果。
参考文献（略）