第 1 章 引言
1.1 疟疾的流行趋势和防治现状
疟疾是一种由疟原虫引起的，以雌性按蚊作为传播媒介的虫媒传染病，是除结核、艾滋病之外另一严重危害人类健康的疾病，更是全球三大公共卫生问题之一[1]。可寄生于人体的疟原虫共有五种：间日疟原虫（Plasmodium vivax）、恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）、三日疟原虫（Plasmodium malariae）、卵型疟原虫（Plasmodium ovale）和诺氏疟原虫（Plasmodium Knowlesi），其中以间日疟和恶性疟较为常见[2-3]。寄生于人体的疟原虫需要两种宿主即人和雌性按蚊，且均具有无性生殖和有性生殖两个世代。在人体内进行的是无性生殖，而起始于人体却在雌性按蚊体内完成的是有性生殖。人体内的疟原虫发育又可分为两个阶段分别是肝细胞内和红细胞内，在按蚊体内的疟原虫发育则分为蚊胃内的配子生殖阶段和蚊胃壁上的孢子增殖阶段。而红细胞内的疟原虫又可根据各时期的发育形态分为滋养体期、裂殖体期以及配子体期，并且寄生于人体的五种疟原虫的红细胞内三个时期的发育形态有其各自的特点，可用于不同疟原虫的鉴别。其中，在各发育期的红细胞内均可寄生的是恶性疟原虫，主要寄生在网织红细胞内的是间日疟原虫和卵形疟原虫，而三日疟原虫则多寄生于较衰老的红细胞内。疟疾的主要致病阶段是红细胞内期的裂殖体期，当红细胞被存在于红细胞内期成熟的裂殖体胀破后，大量裂殖子、疟原虫代谢产物及红细胞碎片等流入血液，其中可被吞噬细胞和中性粒细胞吞噬一部分，刺激这些细胞产生内源性热原质，进而再与疟原虫代谢产物共同作用于宿主的下丘脑体温调节中枢从而导致患者出现寒战、高热、出汗等症状[3-4]。
近年来，随着全球疟疾诊断技术和治疗水平的提升以及防控措施的不断加强，全球疟疾流行范围正在逐渐缩小，但疟疾死亡病例数仍居高不下、局部地区的疟疾发病数甚至有所上升[5]，以及诸如难以识别极低密度疟原虫感染[6]、耐药性疟原虫种群扩增[7-8]、抗疟药储备种类匮乏的问题[9]等多种技术难题胶着存在，使得消除疟疾工作正面临着新的挑战。世界卫生组织（World Health Organization, WHO）最新报道显示，仅 2019 年全球的疟疾感染病例估计有 2.29 亿，死亡病例更是达到了 40.9 万人，其中 94%的感染病例和死亡病例来自非洲，另外还有 3%的全球疟疾负担来源于东南亚 9 个国家，对全球的人类健康造成了巨大的威胁，也为全球的经济和发展带来了巨大的负担[5]。
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1.2 间日疟复发及其治疗研究进展
间日疟原虫是 5 种感染人体的疟原虫中分布最为广泛的一种，主要分布于东南亚、南美洲、大洋洲以及北非等地区。尽管间日疟的临床症状及病死率不及恶性疟严重，但间日疟原虫成熟配子体（V 期配子体）几乎与无性体同时出现在疟原虫血症早期[12]（云南省 2019 年诊断的间日疟病例中，超过 80%的病例就诊时可查见 V 期配子体[13]），整个感染期亦不断生成配子体，而不似恶性疟原虫迟于无性体 10 天才出现成熟配子体，所以传播效率更高。另外，相较恶性疟原虫，间日疟原虫在按蚊体内发育更快，容易规避杀虫剂浸帐、室内残留喷洒等措施的干预，所以同处媒介控制的压力下间日疟原虫的种群得以逆势上涨[14]；再加之少数间日疟原虫可在肝脏的裂殖体时期进入一个休眠期，称为休眠子，该休眠子可在最初感染后的数月甚至数年被重新激活从而导致间日疟复发，不仅导致间日疟的传播可以突破蚊媒传染病的地方性和季节性限制[15-16]，隐蔽的传染源蓄积作用，在复杂化间日疟传染源方面更起到了推波助澜的作用。世界人口的 40%受间日疟危害影响，因其易于复发以及传染源累积效应大，使得间日疟比恶性疟更加难以控制和消除，近年间日疟的影响面甚至高于恶性疟也成为消除疟疾阶段面临的挑战之一[17-18]。WHO 2020 年的疟疾年报公布[5]，全球 2019 年约四分之一的疟疾病例是由间日疟原虫引起。据统计 2011-2019 年全国输入性疟疾中间日疟病例占到了25.26%，而云南省占到了全国间日疟病例的 57.2%（4226 例）[11]，是全国间日疟病例输入最多的省份，病例主要由东南亚各国感染输入，并且 2018 年全省的疟疾病例中间日疟更是占到了 89.8%（203/226）[19]，其中，90%以上就由缅甸感染输入，其余为老挝、泰国等国家。203 例间日疟中又不乏多次发作、经论证排除重新感染的疑似复发群体[20]，所以有效根治间日疟是云南消除疟疾进程中必须认真落实的传染源清除和传播阻断措施。
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第 2 章 实验材料与方法
2.1 实验试剂与仪器
2.1.1 主要实验仪器
2.1.2 主要试剂配制
（1） 1×TAE 稀释配制: 将 50×TAE 电泳缓冲液按一定比例加超纯水稀释至1×TAE 实验浓度常温保存以备用。
（2） 引物稀释：取出上下游引物 10000 rpm 离心约 1 min 后，按引物说明加ddH2O 溶解至 100 umol/L,再取 20 ul 溶解后的引物加入 80 ul 的 ddH2O 稀释至 20umol/L，置于-20℃保存备用。
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2.2 研究对象与样本采集
2.2.1 间日疟疑似复发与未复发判断标准
（1） 间日疟疑似复发病例（Suspected relapsed cases of vivax malaria，SR）：①流行病学追踪：在初次诊断后 28-180 天内被重新诊断为间日疟原虫感染，且他们在两次临床疟疾发作之间没有再次暴露于疟疾传播地区的经历[70]。②基因比对：历次发作的感染虫株进行间日疟原虫环子孢子表面蛋白（circumsporozoite surfaceprotein, csp）和裂殖子表面蛋白 1（merozoite surface protein 1, msp-1）基因的 PCR扩增，分别以参考序列（ID：LT635619.1）和（ID：LT635618.1）为模板设计两个基因的 PCR 扩增引物和反应条件（表 2.3），所获得的 PCR 扩增产物送测序公司测序，测序序列在 NCBI 平台进行识别以识别率（Identities）大于 99%、查询覆盖率（Query Cover）大于 96%为标准确认是否属间日疟原虫基因目标序列。用 DnaSP6.11.01 软件识别同一患者、不同发作期的间日疟原虫 csp、msp-1 基因片段的单倍型，并计算可变位点数（Variable sites）和期望杂合度（He），当单倍型为 1、可变位点数和期望杂合度均为 0 时，表明同一患者、不同发作期检出的间日疟原虫基因完全同源，即各次发作由同一疟原虫克隆株引起。满足上述两个条件的病例被认为是间日疟疑似复发病例。
（2）间日疟未复发病例（Non-relapsed cases of vivax malaria, NR）：间日疟发作后随访一年无间日疟再次发作史的病例被认定为间日疟未复发病例。
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第 3 章 实验结果............................... 22
3.1 样本信息......................................... 22
3.2 CYP2D6 基因外显子 exon 1～9 编码区的 PCR 扩增....................... 23
3.3 CYP2D6 基因 CDS 链的多态性分析............................... 24
第 4 章 讨论............................... 37
第 5 章 结论与展望............................................ 41
第 4 章 讨论
CYP2D6 基因单加氧酶活性从完全的功能障碍到超快速发挥酶代谢功能的异质性[59,76]，均能追溯到一定的 CYP2D6 基因型存在，在已识别的 140 余个等位基因中（不包括子变量），CYP2D6*3、CYP2D6*4、CYP2D6*5 和 CYP2D6*6 等多个突变型等位基因被认为与 CYP2D6 的酶活性降低具有关联性[52,78]。尽管早有研究表明 CYP2D6 基因对间日疟抗复发药物伯氨喹的代谢有一定的影响，但云南省作为输入性间日疟高发地区对该基因的相关研究还是一片空白，本研究首次对云南省 2014~2020 年期间，使用伯氨喹根治间日疟患者的人 CYP2D6 基因的全基因编码区多态性及其与间日疟复发易发的关联性进行了分析。
本研究收集的 350 份病例样本母体 CDS 链的获得率为 93.2%，说明 CYP2D6基因的 PCR 扩增效率较高，这可能与 CYP2D6 基因内部不存在 Poly-T/A 结构、DNA 聚合酶不易在模板上打滑利于 DNA 链延伸有关。迄今，已发现的 CYP2D6基因突变位点已超过 120 个，等位及亚等位变异体更是超过 300 种[34]。本研究在652 条 CYP2D6 全基因编码区序列中检出的 c.31（rs769259）、c.100（rs1065852）、c.886（rs16947）、c.1457（rs1135840）等 12 种位点突变均为先前研究已发现的多态性位点，但由它们组合形成的等位形式[34]却出现了 56.0%（14/25）的无法对其进行命名和赋分的等位形式[35-36,47-48]，因而无法进行统计学分析，也给依据双倍体基因型分值预测 CYP2D6 酶活性表型带来不便，究其原因可能与既往的等位确认标准[34,74]对全基因测序获得的突变位点组合不敏感有关，同时也不排除本研究未检测内含子的多态性位点从而导致 CYP2D6 基因等位识别产生的准确性不足。
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第 5 章 结论与展望
本课题采用巢式 PCR 方法检测了云南省间日疟患者（间日疟疑似复发病例和间日疟未复发病例）的 CYP2D6 基因全编码区遗传多态性，对云南省间日疟患者CYP2D6 基因多态性与间日疟复发易发之间的关联性进行分析，一定程度弥补了中国关于伯氨喹根治间日疟复发失败遗传关联因素方面的研究空白。重要发现包括：
（1）本研究从 326 例间日疟样本中共检出 12 个突变位点，同义突变位点 5个，非同义突变位点 7 个，均为已知突变位点，无新发现突变位点。c.1457（rs1135840）为突变频率最高的位点（70.2%)，其次为 c.408（rs1058164）的 69.8%。突变位点主要存在与 exon 1~3、exon 5~6 以及 exon 9 等外显子区域，且 exon 3 和exon 9 为突变位点的高发区。
（2）获得的 652 条 CDS 链共识别出 25 种单倍型，其中有 11 种单倍型可进行准确的亚等位基因命名，另外 14 种单倍型在“人类细胞色素 P450 等位命名委员会数据库”无准确的命名标准。
（3）11 种已知的亚等位基因可归类为*1、*2、*4、*10 和*39 等 5 种星等位基因，其中最常见等位基因为 CYP2D6*10。由 5 种星等位组成的*1/*1、*2/*2、*1/*2、*2/*10、*1/*10、*10/*10、*10/*39、*39/*39、*2/*39、*4/*4 等 10 种基因型中，*10/*10 基因型为发生频率最高的基因型。
（4）对本研究获得的 CYP2D6 全基因编码区序列进行核苷酸多样性分析显示，CYP2D6 基因核苷酸多样性较高，DNA 序列差异较大，不属于定向选择压力下的非中性突变，且在进化过程中受正向多元选择影响较大。
（5）在对CYP2D6全基因编码区多态与间日疟复发易发的关联性分析结果显示，c.271、c.281、c.294、c.505、c.408、c.1457 等 6 个位点突变与间日疟复发的关系最为密切，*1 等位基因和*1/*1 基因型对间日疟复发的发生是一种保护因素，而*4 和*39 等位基因以及*10/*39 基因型可能会增加间日疟复发的风险。
参考文献（略）