第一部分：ADH7 基因 SNPs 在中国北方汉族群体中与精神分裂症的关联及法医学意义
1 前言
精神分裂症是一种严重的神经发育障碍疾病，其主要症状包括幻觉、妄想、认知障碍、言语混乱、运动行为异常等[1]。在某些刑事案件中常涉及到精神分裂症的鉴别问题。法医精神病学鉴定时，由于临床精神症状复杂多变，缺少客观的“生物学指标”，从而导致对精神疾病的诊断结果更多地受个人主观意识影响，并不能真实有效地反映出被鉴定人实际的精神状态，造成法医精神病学鉴定结果的不一致而给相应的司法鉴定造成困惑。遗传因素是重要的病因已成共识，如多巴胺能、5-羟色胺能学说等，对中枢神经功能有作用的基因都有可能参与了精神分裂症的发生，因此被认为是多基因疾病[2]。其终生患病率约为0.5 ~1.5%[3]，遗传率高达80% [4]，但发病机制尚不清楚。人类基因组信息和分子生物学技术的最新进展，促进了精神分裂症基因研究的重大进展，许多研究都集中在与精神分裂症发病机制相关的神经递质及调控神经递质的基因或蛋白质上，而乙醇脱氢酶（Alcohol Dehydrogenase ，ADH）参与多种神经递质的代谢途径，提示其可能与精神分裂症的发病具有相关性，为精神分裂症发病机制的研究提供了新的思路。对大脑产生明显的影响，产生认知障碍、学习和记忆功能障碍等精神方面的障碍和脑损伤[12]。体外实验表明，乙醇可以作为ADH7对视黄醇氧化的竞争性抑制剂[13]。因此，乙醇通过ADH途径竞争性抑制视黄醇的氧化，可导致维甲酸水平降低和维甲酸对人脑的调节功能受损。Martínez SE等人采用原位杂交技术检测成年大鼠大脑多个区域的组织切片，ADH7基因在浦肯野细胞、海马的锥体和颗粒细胞以及大脑皮层的锥体细胞中均有表达，同时在中枢神经细胞上皮和血管组织中高水平表达，Western blot分析显示大脑多个区域的匀浆中均含有ADH7蛋白[14]。此外，还有研究表明ADH7基因与物质依赖（包括酒精依赖和药物依赖）[15, 16]、重度抑郁[17]及帕金森病[18]之间存在关联，提示ADH7基因可能参与中枢神经系统疾病的发病机制。
ADH7基因位于4号染色体长臂上；全长23250bp，含有9个外显子和8个内含子，目前共发现有6819个SNPs；而SNPs是人类基因组中含量最丰富的DNA序列多态性，在各种群中普遍存在，其多态性超过90％，并且检测片段更短、检测技术更加高效，更适用于高度降解检材分析；其次，有些SNPs可预测种族来源或表型特征，可用于人体生物特征的刻画。根据NCBI数据库的SNPs的基础数据，我们统计了ADH7基因最小等位基因频率 > 0.01的SNPs位点，5'端共8个SNPs，3'端共9个SNPs。因5'端和3'端对ADH7基因的调控作用，我们选取了含有频率较好SNPs的2个调控区部分片段进行研究。
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2 材料与方法
2.1 主要试剂和仪器
2.1.1 主要试剂
LA-Taq DNA 聚合酶（大连宝生物工程有限公司） 特异性引物（金唯智生物科技有限公司） 限制性内切酶 Bfa I（纽英伦生物技术（北京）有限公司） 琼脂糖（中科瑞泰（北京）生物科技有限公司）DNA Ladder（宝生物公司（大连）有限公司） Green 凝胶核酸染料（宝生物公司（大连）有限公司） 6×Loading Buffer（宝生物公司（大连）有限公司） 苯酚、氯仿、无水乙醇（北京化工厂）
2.1.2 主要仪器
PCR 仪（TP600，大连宝生物工程有限公司） 电泳槽（DYY-III33A，北京六一仪器厂） 紫外透射光源（LKB2011Macro VUE，上海玉博生物科技有限公司） 电泳仪（ESP 500/400，上海玉博生物科技有限公司） 紫外分光光度计（Nanodrop 2000，中国赛默飞世尔科技有限公司） 恒温金属水浴（K30，上海之信有限公司） 恒温水浴槽（SY-1220，上海巴玖实业有限公司） 高速台式离心机（Micro17R，中国赛默飞世尔科技有限公司） 凝胶成像系统（MiniBis Pro，以色列 DNR 成像系统有限公司） 多用途摇床器（QB-208，其林贝尔海门仪器制造公司） 电子天平（SPS202F，上海奥豪斯仪器有限公司）
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第二部分：ADH7 基因 5'启动子区对基因表达调控的功能分析
1 前言
ADH7 基因编码 IV 类酒精脱氢酶，主要在上消化道表达。广泛的基因组研究已经确定了 ADH7 基因与酒精依赖、药物依赖、重度抑郁、帕金森病和上消化道癌症等疾病的关联[28]。IV 类酒精脱氢酶的独特之处在于其较强的视黄醇氧化能力，进而参与维甲酸（RA）的代谢过程[29]。据报道维甲酸信号通路的改变可能与严重精神障碍的发病机制有关，如精神分裂症、抑郁症和阿尔茨海默病等[30-32]。有研究表明，维甲酸结合蛋白，维甲酸受体和参与维甲酸氧化的酶位于表达ADH7 的成年大鼠的中枢神经系统血管和神经组织的同一细胞群内[33, 34]。而且，在维生素 A 缺乏或过量的情况下，ADH7 基因突变小鼠对维甲酸的利用存在缺陷[35]。这些证据表明，ADH7 基因可能通过参与维甲酸的生成进而影响神经精神疾病的进展。
基因表达的调控主要体现在转录水平上的调节，转录因子通过与基因组调控区域的结合参与基因表达的调控[36]。编码区仅占人类基因组 1%，许多疾病的遗传关联更有可能存在于非编码序列中[37]。Sowmya Jairam 等人的研究表明近端启动子的两个单倍型 rs2851028-C 和 rs2851028-T 具有不同的转录活性。rs2851028-C 与 rs2851028-T 相比，上游调节序列通常表现出较大的活性增强或较小的活性降低[38]。因此 ADH7 基因 5'启动子区的单核苷酸多态性可能也会影响基因转录。单个 SNP 的遗传关联研究已经广泛开展，而在单倍型染色体上对多个相邻 SNPs 的研究也逐渐引起了越来越多的兴趣。在精神分裂症这种复杂疾病中，它们可能比单个 SNP 能够更有效地进行易感基因识别，当它们同时发生特定单倍型上的遗传变异时可能会产生独特的表型。ADH7 基因的调控区有大量SNPs，包括不同的单倍型，直接或间接影响 mRNA 的表达，从而影响 ADH7 蛋白的表达。有趣的是，之前在一项 ADH7 基因结构和功能的研究中发现转录因子AP-1 和 C/EBP 与启动子区域的结合显著降低了其活性[39]。
我们从 275 个精神分裂症患者和 313 个健康个体中检测出 ADH7 基因 5'近端启动子区域中的 3 个 SNPs。为了分析 ADH7 基因启动子区的调控作用，我们克隆并测序了包含起始密码子 ATG 的启动子片段（-1626~+107 bp）和另一个包含 3 个 SNPs（-649~+46 bp）的片段。此外，我们构建了四个单倍型和多个重组片段质粒，以表征 ADH7 启动子对基因表达的影响。
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2.2 材料与方法
2.2.1 实验样品
基于我们之前的研究[28]，包含 4 个单倍型（T-C-T、T-T-T、T-T-C、A-C-T）DNA 样本被选作用于 PCR 扩增目标片段的模板。
2.2.2 ADH7 基因 5'启动子区单倍型及不同长度片段截断体的重组载体目的基因引物设计
根据 pGL3 质粒多克隆位点使用 Primer 5.0 软件设计引物并选择限制性内切酶。在构建单倍型重组载体时，把相应的引物 5'端引入 KpnⅠ和 HindⅢ限制性内切酶，引物序列是 5'-CGGGGTACCGATTTGGAGTCAGATG-3'（正向）；5'-CCCAAGCTTCATCCTGTCTTTGTCTTG-3'（反向）。带下划线的核苷酸以引入KpnⅠ或 HindⅢ的限制性酶切位点。
在构建不同长度片段重组载体中，共同末端在+107 bp（ATG 为+1）。将最长片段（-1626 bp ~+107 bp）用作扩增模板，以构建 8 个具有 5'缺失截断的片段。将含有限制性内切酶 KpnI 和 Bgl II 酶切位点的引物（表 2.1）引入 5'端以扩增靶片段。
法医学论文参考
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第三部分：ADH7 基因 3'非编码区对基因表达调控的功能分析
1 前言 ................................... 32
2 材料与方法 ........................... 33
2.1 主要试剂和仪器..................................... 33
2.1.1 主要试剂.......................... 33
2.1.2 主要仪器......................................... 33
4 讨论 ........................................ 41
5 结论 ............................................... 42
4 讨论
本研究旨在探讨 ADH7 基因 3'非编码区对基因表达的影响，我们通过克隆和测序方法构建了 4 种单倍型和 8 个具有不同序列长度的片段的重组载体，并且进一步转染 HEK-293 细胞、U87 细胞和 SH-SY5Y 细胞以分析体外蛋白表达情况。
在进行单倍型的比较时，我们发现在 U87 和 SH-SY5Y 细胞系中，单倍型 H2的相对荧光强度最高，且与 H1 和 H3 相比存在显著性差异。然而这与我们先前在正常群体与精神分裂症群体中单倍型的分布频率统计分析结果不一致[72]，这个结果可能是由于本实验只是通过细胞实验来验证了单倍型对基因转录的影响，因此对之前的阴性结果也要慎重分析。另外，根据之前对于单倍型连锁关系的分析结果可以得出 rs4147554、rs284786、rs3805331、rs894369、rs3805329、rs284787和 rs729147 存在高度连锁不平衡关系，单倍型之间相对荧光强度差异比较分析的结果可能与这种紧密连锁关系有关。单核苷酸多态性可能影响 MiRNA 与靶mRNA 3' 非 编 码 区 域 的 互 补 结 合 ， 进 而 影 响 基 因 表 达 。 我 们 使 用TargetScanHuman7.2 数据库进行序列分析，在 rs284786 位点发现多个候选miRNAs，如 miR-190a-3p、miR-4424、miR-8081。其中，miR-190a-3p 在之前的研究中被发现是抑制术后认知功能障碍患者海马组织中靶基因表达的重要调节因子，可能参与精神疾病的病理过程[73]。而在针对 rs284786 和 rs1154470 位点的单倍型研究中发现 ADH7 基因调节物质依赖者的外向性和自觉性[15]；另外，Edenberg et al.等人发现 rs284786 与酒精中毒存在关联[24]。rs284786 可能通过修饰 MiRNA 与 mRNA 的靶向结合来调控相应基因的 mRNA 表达水平，最终对疾病产生影响。
法医学论文怎么写
本研究通过截断的方法进一步缩小与调控因子结合序列的靶点范围，以探究ADH7 基因 3'非编码区域潜在的功能序列。我们发现在+468~+564 bp 的区域内三种细胞系相对荧光强度均下调。MiRNA 与靶 mRNA 3'非编码区域结合，进而调控基因表达是其最常见的作用机制。因此，我们推测+468~+564 bp 区域可能是潜在 的抑 制基因 表达的 MiRNAs 效应 子结 合 位 点。我 们进一步通过TargetScanHuman7.2 数据库对这一区域进行了 miRNAs 预测，发现了 miR-206 是一种潜在的目标。最近的研究发现，miR-206 在精神疾病患者的前额叶皮层有不同的表达，能够调节突触密度和记忆等重要的大脑功能[74, 75]。
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5 结论
5.1 ADH7 基因 3'非编码区多态性对基因表达具有调节作用。
5.2 ADH7 基因 3'非编码区+258~+380 bp 和+468~+564 bp 区域可能存在诱导抑制基因表达的 miRNAs 结合位点。
参考文献（略）