第一章 红花蜂花粉多糖多糖的提取、分离纯化
1 实验材料
1.1 实验原料
破壁红花蜂花粉，云南滇峰蜂业有限责任公司产品，批号：2018026。按GB/T1014-1999 标准鉴定为红花蜂花粉。
1.2 试剂
D-葡萄糖标准品（D-Glc），D-葡萄糖醛酸标准品（D-GlcU A）；石油醚，苯酚、正丁醇、氯化钠、丙酮、95%乙醇、乙醚、磷酸、硫酸（均为 AR），上海一研生物科技有限公司。DEAE-52 纤维素，Whatman 公司产品。Saphadex-G75（Pharmacia），Solarbio。透析袋（分子截留为 3500 Da）为上海绿鸟公司产品。BCA Protein Assay Kit，Solarbio。
1.3 主要仪器设备
医学论文参考
2 实验方法
2.1 碱提多糖的提取分离、纯化
2.1.1 碱提多糖的提取
称取破壁红花蜂花粉 500 g，分别用石油醚、95% 乙醇各回流 2 h，过滤，室温晾干滤渣后，加 20 倍体积蒸馏水，80℃ 水浴提取 10 h，连续提取 2 次，去除水溶性多糖，过滤，滤渣晾干后加 20 倍体积 0.5mol/L 的 NaO H 溶液，40℃恒温水浴提取 2.5 h，重复提取 3 次，过滤，合并 3 次提取的滤液，滤液自然冷却至室温后，用 0.5 mol/L 盐酸溶液调节 pH 至 7.0，减压浓缩至适当体积后，加95%乙醇至终浓度为 75%（V/V），置 4℃过夜，4000r/min 离心 20 min，弃上清，取沉淀溶于少量蒸馏水，Sevage 法脱蛋白，离心，取上层水相，重复脱蛋白至 280 nm 无明显吸收峰。合并脱蛋白尽的水相，4℃ 醇沉，离心，沉淀复溶于少量蒸馏水，去离子水透析（MWCO 3500 Da）24h，合并袋内液，醇沉, 离心，沉淀分别用无水乙醇、乙醚、丙酮洗涤 3 次，冷冻干燥，得稀碱提取红花蜂花粉总多糖（APBPC），置干燥器中备用。
2.2 多糖提取率、总多糖中多糖含量测定
按文献[45-46]方法进行。采用硫酸-苯酚法，以葡萄糖作为标准对照品建立标准曲线，并测定出多糖与葡萄糖的换算因子 f，按下列公式分别计算样品多糖含量与原料多糖提取率。
样品多糖含量（%）=（C× D× f /m）×100 （1）
式中：f 为换算因子，W 为称取样品多糖的质量（μg），C 为样品葡萄糖含量（μg/mL），D 为稀释因子。
原料多糖提取率(%)=[样品中多糖的质量分数（%）×多糖样品的质量（g）/红花蜂花粉原料的
将冷冻干燥的碱提粗多糖（APBPC）溶于少量蒸馏水，离心取上清液，上DEAE-52cellulose 柱（2.0cm×50cm），依次用蒸馏水、0.1 、0.2 、0.3 、0.4、0.5、1.0 mol/L 的 NaC l 溶液洗脱，流速 1.0 mL/min，每管收集 4 mL，苯酚-硫酸法检测，收集 A490nm 有吸收峰的主要部分，减压浓缩、去离子水透析除盐，醇沉、冷冻干燥，得碱提红花蜂花粉多糖（APBPC）的不同级分。将不同级分的 APBPC 分别溶于适量蒸馏水，上 Saphadex-G75 柱（1.6cm×48cm），蒸馏水为洗脱，流速 0.2mLL/min，每管收集 4mL，硫酸-苯酚法检测，收集合并 490nm出峰部分，减压浓缩至适当体积，醇沉，离心，沉淀冷冻干燥至恒重后，得纯化的 APBPC 级份，灭菌管密封，置干燥器中保存备用。参考文献[45-46]方法，采用硫酸-咔唑法法测定糖醛酸含量。分别配制系列浓度的葡萄糖醛酸溶液为对照品，双蒸水为空白对照，在 525 nm 处测吸光度值(A)，以 A 值为纵坐标，葡萄糖醛酸浓度为横坐标，进行线性回归，得回归方程 y =0.0046x-0.0068, R2 =0.9998。取收率较高的多糖级份样品，同法处理，分别测定其糖醛酸含量。
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第二章 碱提红花蜂花粉多糖 APBPC-2 的结构初步分析
1 实验材料与仪器
1.1 主要试剂
医学论文参考
2 实验方法
2.1 分子量与均一性测定
由于多糖为高分子聚合物分散体系，其分子量具有分散性。故本实验采用HPGPC 法测定分子量及均一性。分子量校正曲线的制备：取右旋糖酐分子量标准对照品 DXT4K，DXT20K，DXT44K，DXT72K，DXT160K，DXT300K，DXT555K，DXT1185K，DXT1900K，用流动相分别配制为质量浓度约为1.0mg/mL 的系列标准溶液，离心，0.45 μm 滤膜过滤后备用。色谱条件：Agilent1260 infinite 系统，TOSOH 公司凝胶渗透色谱柱 TSK-G5000（300 mm×7.8 mm，分离范围：5.0×104-2.5×106 Da）与 TSK-GEL G4000PWXL（300 mm×7.8 mm，分离范围：1.0×103-7.0×105 Da）串联。柱温 35 ℃，流动相：0.025 mol/L NaH 2PO4与 Na2HPO4 溶液（pH6.7），加 0.05 % NaN 3。流速 0.8 mL/min，分别取不同分子量的对照品溶液 20 μL 注入凝胶色谱柱，示差折光检测器（RID）检测（恒温35 ℃），记录保留时间。以分子量的对数值 LogMW 为纵坐标，以相应色谱峰的保留时间 tR 为横坐标，用 GPC 软件拟合建立分子量标准校正准曲线及二次拟合分子量校正曲线回归方程。
样品处理：准称取APBPC-2样品，用流动相溶液配制成质量浓度为 1.0 mg/mL 的溶液，离心（10,000 rpm）10 min，取上清液，0.45 μm 滤膜过滤，按分子量标准曲线分析方法同法操作进行检测。根据样品洗脱曲线的峰型判断样品的均一性，通过 Agilent 配套色谱工作站 GPC 软件计算样品的分子量与分布范围。
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第三章 APBPC-2 的体外抗肿瘤活性与机制研究.....................................21
1 材料与仪器.......................................... 21
1.1 实验材料和试剂.............................................21
1.2 主要实验设备.............................................21
结论...............................54
第三章 APBPC-2 的体外抗肿瘤活性与机制研究1 材料与仪器
1.1 实验材料和试剂
1.1.1 实验细胞株
人乳腺癌细胞株（MDA-MB-231）、人乳腺癌细胞株（MCF-7）、人前列腺癌细胞株（DU-145）、人肝癌细胞株（HepG-2）（均来源于中科院 ATCC 细胞库，提供有细胞鉴定书），为我室保种传代。
1.1.2 主要实验试剂与材料
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结论
1. APBPC-2 为酸性多糖，葡萄糖醛酸含量为 11.78%。APBPC-2 的 Mw 为2.1106×105 Da，Mn 为 1.3652×105 Da ，分布系数 D=1.5460。APBPC-2 由 L-Rha,D- GlcUA,D- Glc,D- Gal,L- Ara 等 5 种单糖组成，摩尔比为 11.93：10.06：13.37：10.29：8.79。APBPC-2 分子内同时存在 与β异头碳构型。
2. APBPC-2 的体外抗肿瘤活性与机制研究
APBPC-2 具有显著的体外抗肿瘤活性。APBPC-2 的抗肿瘤作用机制与其调控 pten、PI3K、Akt 基因表达，进而阻碍 PI3K/AKT 信号通路，并调控 bax、caspase-3、p53、bcl-2 基因表达，抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡密切相关。
参考文献（略）