第一章 基于肿瘤公共数据库分析 TEFM 在 HCC 中的表达及预后意义
1.1 资料与方法
1.1.1 利用 Oncomine 芯片数据库分析
TEFM 在 HCC 组织与正常组织表达差异 本研究使用 Oncomine 数据库设定 TEFM 与 HCC 相关数据集筛选条件，首先设置基因名为 C17orf42，设置数据分析类型为癌症与正常组织相比，设置癌症类型为肝细胞性肝癌，数据类型为 mRNA，样本类型为临床病例，最后进行临界值的设定，P 值<1E-4。数据集筛选完成后，分析全部 TEFM 与 HCC 相关研究，观察 TEFM 在 HCC 组织中的表达情况。随机选择两组研究进行分析，观察 TEFM 在 HCC 组织与正常肝组织的表达差异。
1.1.2 利用 UALCAN 网站分析 TEFM 在 HCC 组织与正常肝组织表达差异以及临床病理相关性
UALCAN（ http://ualcan.path.uab.edu/analysis.html ）是一个综合的交互式 Web网络资源，包括 31 种癌症类型，提供了基于癌症基因组图谱（TCGA）和 MET500队列数据的分析。可用于分析肿瘤和正常组织之间基因的相对转录表达，以及转录表达与相对临床病理参数的关联。在本研究中，使用 UALCAN 的“表达分析”模块和“LIHC”数据集获得了 TEFM 的表达数据。分析 TEFM 在 HCC 组织与正常肝组织表达差异以及临床病理相关性。通过 t 检验比较基因转录表达的差异，P<0.01 被认为是具有极其显著差异的。
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1.2 实验结果
1.2.1 TEFM 在 HCC 中的表达结果
Oncomine 数据库检索发现，共有 5 项对 TEFM 在正常肝组织和 HCC 组织表达的芯片研究，文章分别发于 Mol Biol Cell，2002，Mol Med，2008，Cancer Res，2010，Cancer Res，2010 和 Hepatology，2007。荟萃 5 项研究结果发现，与正常肝组织相比较，TEFM 在 HCC 中的表达升高，中位数值为 2179.0，P<0.05（图 1.1）。
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第二章 组织芯片及免疫组织化学技术分析 TEFM 在 HCC中的表达及临床病理意义
2.1 实验材料
2.1.1 HCC 组织收集及患者临床资料
本研究共收集了 70 例 HCC 患者的组织标本，包括 HCC 确诊病例组织和配对的癌旁组织标本，这些 HCC 组织芯片样本购自于武汉赛维尔生物公司，包括男性 66 例，女性 4 例，年龄 14.0～69.0 岁，中位年龄 47.5 岁。70 例患者均首次确诊为 HCC，未经放疗、化疗等手段直接进行手术治疗。HCC 患者的组织标本根据美国癌症联合委员会（AJCC）/国际抗癌联盟（UICC）肿瘤淋巴结转移（tumor node metastasis, TNM）分期系统进行分期，其中Ⅰ期 25 例，Ⅱ期 5 例，Ⅲ期 33 例，Ⅳ期 7 例。本研究的临床相关资料以及临床样本的回顾性研究均通过大理大学医学伦理委员会批准（2018-12），所有患者均签署知情同意书。
2.1.2 实验主要器材
本实验所用的仪器主要有：购置于上海泰事达机电设备有限公司的生物安全柜，型号为：TELSTAR B2；购置于 DIAPATH 的全自动组织脱水机，型号为：Donatello；购置于武汉俊杰电子有限公司的石蜡组织包埋机和生物组织冷冻台，型号为：JB-P5 和 JB-L5；购置于上海徕卡仪器有限公司的石蜡切片机，型号为：RM2016；购置于上海徕卡仪器有限公司的石蜡切片机，型号为：RM2016；购置于浙江省金华市科迪仪器设备有限公司的生物组织摊片机，型号为：KD-P；购置于上海慧泰仪器制造有限公司的烤箱，型号为：DHG-9140A；购置于莱卡（LEICA）仪器有限公司的磨砂载玻片，型号为：Arcadia；购置于上海永科光学仪器有限公司的荧光倒置显微镜，型号为：YKY-1200；购置于日本尼康的成像系统，型号为：Nikon DS-U3；购置于格兰仕微波炉电器有限公司的多功能微波炉，型号为：P70D20TL-P4；
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2.2 实验方法
2.2.1 石蜡切片制作
1. 用固定液将新鲜 HCC 和正常肝组织固定 24 h 以上。然后将固定好的组织取出来后在超净台内修平整所需要的部位组织，然后放于脱水盒内进行脱水。
2. 最常用的脱水剂是酒精，脱水步骤一般按酒精浓度从低到高进行。将脱水盒依次放入 75%酒精、85%酒精、90%酒精和 95%酒精里脱水 4 h、2 h、2 h 和 1 h，使用两次无水乙醇分别脱水 30 min。
3. 组织进行脱水后使用醇苯 5-10 min，使用两次二甲苯，每次 5-10 min 将将组织进行透明处理，使透明剂与脱水剂融合，使石蜡更好的渗入组织。
4. 包埋 HCC 和正常肝组织所需要的石蜡，熔点大概 65℃，本研究使用 65℃分别融化石蜡 1 h，共 3 次。
5．对 HCC 和正常肝组织进行包埋，此过程使用包埋机，先将上个步骤融化好的蜡倒入包埋机的包埋框中，迅速将处理好的组织在蜡凝固之前从脱水盒取出，切面朝下，放入包埋框，并贴上 HCC 组织与正常肝组织的标签。放置于-20℃冻台冷却，直至蜡凝固，30 min 左右取出蜡块，将蜡块用加热的刀片四周修平，上下两面修成平行面。
6．在包埋后，就可以将修整好的肝组织蜡块进行切片处理。首先放入-20℃冻台进行冷却，再将冷却的肝组织蜡块置于石蜡切片机进行切片，切片厚度大约为 4 μm。切片必须贴附于摊片机上将组织展平， 投放于 40℃温水浴，使用载玻片将组织捞起，放置于 60℃烘箱内将切片摊干。最后，取出切片，常温保存备用。
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第三章 TEFM 蛋白在 C57 小鼠的组织表达谱以及 HepG2 细胞周期进程的表达 .......... 45
3.1 实验材料 ..................................... 45
3.1.1 C57 小鼠和细胞株 ........................................... 45
3.1.2 实验主要试剂 ...................................................... 45
3.1.3 实验主要仪器 ............................................... 45
结论 ................................. 56
第三章 TEFM 蛋白在 C57 小鼠的组织表达谱以及 HepG2细胞周期进程的表达
3.1 实验材料
3.1.1 C57 小鼠和细胞株
小鼠为雌性 C57 小鼠，体重为 207g，6 周龄，购自大理大学实验动物中心，饲养条件为温度 22℃左右，湿度 55%左右，明（12h）暗（12h）循环饲养。本研究均符合中国伦理委员会有关动物研究指导原则。
人类正常肝细胞（THLE-2）和 6 种 HCC 细胞（SMMC-7721、BEL-7402、Hep3B、HepG2、QGY-7701 和 SK-Hep1）均源自于中国科学院上海细胞库，液氮长期保存。
3.1.2 实验主要试剂
DMEM 高糖液体培养基购自 Hyclone 公司；胎牛血清购自 Gibco 公司；电泳缓冲液粉剂、转膜缓冲粉剂和 Western/IP 细胞裂解液购自 Servicebio 公司；二甲基亚砜（DMSO）、胰蛋白酶-EDTA 消化液（0.25%）、BCA 蛋白质定量试剂盒、SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒和彩虹 130 广谱蛋白 marker 购自 Beyotime 公司；ECL 化学发光液和 PVDF 膜购自 Millipore 公司；EasySee Western marker 购自TransGen 公司；兔抗人 β-action 单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔 IgG 购自 Abcam 公司；兔抗 TEFM 多克隆抗体购自 ABclonal 公司；DEPC 水及其他生化试剂购自上海生工生物工程公司。
3.1.3 实验主要仪器
医学论文参考
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结论
本研究基于公共肿瘤数据库分析了 TEFM 在 HCC 组织中的表达与 HCC 患者临床病理相关性，同时使用组织芯片和免疫组化技术研究 TEFM 蛋白在 HCC组织中的表达及临床意义。此外也从分子水平研究其在 C57 小鼠中的组织表达谱，在不同肝癌细胞中的表达，以及通过血清饥饿和血清再刺激研究 TEFM 基因在 HepG2 细胞周期进程中的表达，揭示 TEFM 基因的表达与 HCC 发生发展、临床病理特征和预后的关系，主要研究结果如下：
1. 肿瘤公共数据库分析发现，TEFM 在 HCC 组织中高表达，TEFM 的高转录水平与患者的性别、血清 AFP 水平和血管浸润密切相关。
2. Kaplan-Meier 分析和对数秩检验结果表明，TEFM 的 mRNA 表达水平与 OS显著相关，TEFM mRNA 的高表达预示肝癌患者的预后不良。在 COX 多因素分析中，年龄、血管浸润和 TEFM 表达水平是导致肝癌预后不良的独立因素。
3. 基因表达相关分析表明 HCC 中 TEFM 的 mRNA 表达水平与 TFAM、TFB1M、MTERF1、MTERF2、MTERF3、MTERF4 和 NRF1 等线粒体转录调控基因的表达水平显着正相关。此外，HCC 中 TEFM 基因的 mRNA 表达水平与 TP53、RASSF1、CDKN2A、EZH2 和 MKI67 等 HCC 标志物基因的表达水平显著相关。
4. TEFM 的表达与 HCC 中的 CD4+T 细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞成正相关。
5. 组织芯片技术检测发现，TEFM 蛋白在 HCC 组织表达水平相较正常肝组织显著升高，在 HCC 组织和正常肝组织中 TEFM 蛋白质的表达主要定位于细胞质当中，TEFM 相对表达量与 HCC 患者的 AFP 具有显著相关性。
参考文献（略）