1 材料与方法
1.1 实验动物
8 周龄雄性 SPF 级 C57BL/6J 小鼠，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司（质量合格证号 No.110324200102581774，No.110324200102925735，No.110324200102333184）。恒温 23±1℃、12 小时明/暗灯光循环饲养，自由进食饮水。
........................
1.2仪器
仪器
溶剂：取 200 μL DMSO、200 μL 吐温-80，以生理盐水稀释至 10 mL，漩涡振荡15 秒，然后超声助溶 10 分钟。
CBD 溶液（3 mg/mL）：以电子天平称取 30 mg CBD，加入 200 μL DMSO，漩涡振荡 10 秒，加入 200 μL 吐温-80，漩涡振荡 10 秒，以生理盐水稀释至 10 mL，漩涡振荡 15 秒，然后超声助溶 10 分钟。
CBD 溶液（6 mg/mL）：称取 60 mg CBD，加入 200 μL DMSO，漩涡振荡 10 秒，加入 200 μL 吐温-80，漩涡振荡 10 秒，以生理盐水稀释至 10 mL ，漩涡振荡 15 秒，然后超声助溶 10 分钟。
布洛芬溶液：称取 90 mg 布洛芬，加入 200 μL DMSO，漩涡振荡 10 秒，加入 200 μL 吐温-80，漩涡振荡 10 秒，以生理盐水稀释至 10 mL，漩涡振荡 15 秒，然后超声助溶 10 分钟。
AM251 溶液：称取 3 mg AM251，加入 200μL DMSO，漩涡振荡 10 秒，加入 200 μL 吐温-80，漩涡振荡 10 秒，以生理盐水稀释至 10 mL，漩涡振荡 15 秒，水浴加热至 60℃ 10 分钟。
................................
2 结果
2.1 小鼠福尔马林口腔颌面部疼痛模型建立
进行口腔颌面部疼痛造模后，与 control 组相比，model 组在注射部位出现明显肿胀（图 3A）。按疼痛指标 1 记录各组抓脸时间（图 3B）。model 组小鼠的抓脸时间呈现经典的两相痛反应：在 6 分钟内小鼠出现快速且密集的注射侧前爪或后爪抓脸行为，该时程反应为一相痛；6 到 12 分钟小鼠几乎无抓脸行为，之后从 12 到 45 分钟小鼠又表现出密集的抓脸行为，该时程反应为二相痛。双因素方差分析显示，处理（F [1，14] = 273，P < 0.001）、时间（F [5，74] = 7.28，P < 0.001）以及两者的交互作用（F [14，196] = 6.62，P < 0.001）均对抓脸时间有显著影响。Tukey 后检验显示，model 组一相痛和二相痛的抓脸时间均明显高于 control 组。
一相痛时程中，model 组小鼠的抓脸总时间显著高于 control 组（t = 7.002，P < 0.001），而 CBD30 组、CBD60 组和 IBU 组抓脸时间与 model 组相比均无显著差异（F [3，28] = 2.231，P > 0.05，图 4A）。二相痛时程中（疼痛指标 2，图 4B），model 组的二相痛抓脸总时间显著高于 control 组（t = 17.13，P < 0.001），model 组和给药组的单因素方差分析显示处理因素显著影响抓脸时间（F [3，28] = 8.567，P < 0.001，n = 8）。Tukey后检验显示，CBD60 和 IBU 组的二相痛抓脸总时间均显著低于 model 组（P < 0.01，P < 0.01），而 CBD30 组抓脸时间与 model 组比无显著差异（P > 0.05）。
图 3 唇部注射福尔马林后肿胀图示与小鼠抓脸时间变化
............................
2.2 唇部组织炎性因子 mR NA 表达变化
福尔马林能够诱发白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子 α（TNF-α）等炎性因子表达上调[28,29]，而炎性因子是痛觉感受器活动和疼痛敏化的关键介质，它们是炎性痛的重要指标[4]。CBD 可能通过抑制 FAAH 活性，上调 eCBs功能发挥药理作用[30]。环氧合酶 2 型（COX-2）是合成前列腺素的关键酶，15-羟基前列腺素脱氢酶（15-PGDH）是其分解代谢的关键酶，它们的变化能够指示前列腺素合成和分解代谢的变化[31]。
在定量实验前，首先检测各引物的扩增效率和特异性，如图 5，从熔解曲线中可以看到，7 个引物均为单峰，特异性良好；标准曲线中各引物斜率接近-2.32，扩增效率在 100%左右。证明本实验选取的 7 个引物在唇部炎性组织中具有良好的扩增特性和特异性。稀释 5 倍的 cDNA 样品的扩增循环数 Ct 值在 23 到 27 之间，内参为 16到 18 之间，以稀释 5 倍的 cDNA 样品进行实验。
本实验中对不同处理组的上述各类因子的变化进行了研究（n = 8），发现与 control组相比，model 组 IL-1β（图 6A，t = 3.578，P < 0.01）、IL-6（图 6B，t = 4.422，P < 0.001）、TNF-α（图 6C，t = 2.728，P < 0.05）以及 COX-2（图 6E，t = 4.861，P < 0.001）的mR NA 表达均显著升高，而 FAAH（图 6D，t = 1.596，P = 0.13）和 15-PGDH（图 6F，t = 0.442，P = 0.67）的表达无显著变化，其中 FAAH 有升高趋势；model 组与给药组的单因素方差分析显示，与 model 组相比，CBD（60 mg/kg）和布洛芬均能显著降低IL-1β（F [2，21] = 8.246，P < 0.01，P < 0.01）、IL-6（F [2，21] = 6.238，P < 0.05，P < 0.05）、TNF-α（F [2，21] = 4.578，P < 0.05，P < 0.05）以及 COX-2（F [2，21] = 5.565，P < 0.05，P < 0.05）的 mR NA 表达，而且 CBD（60 mg/kg）还能降低 FAAH 的 mR NA 表达（F [2，21] = 3.728，P < 0.05），IBU 组 FAAH 的 mR NA 表达与 model 组无显著差异（P = 0.16）；各组中 15-PGDH 的表达未表现出显著差异（F [2，21] = 0.296，P = 0.95，P = 0.89）。
...............................
3 讨论 ................................... 20
3.1 口腔颌面部炎性痛及治疗 .......................................... 20
3.2 福尔马林口颌面部炎性痛模型的建立 ......................................... 20
3.3 CBD 对于福尔马林口腔颌面部炎性痛的药效学作用 ....................................... 20
3.4 CBD 对口颌面部炎性痛发挥镇痛作用的神经生物学机制 ............................... 21
4 结论 ....................................... 23
3 讨论
3.1 口腔颌面部炎性痛的药物治疗
口腔临床上常用的 NSAIDs 类镇痛药物，主要是通过抑制 COX-2 发挥镇痛作用，这类药物不良反应的主要来源是对 COX-1 的抑制[9]。另外，前列腺素对胃、肾的保护等方面都具有作用，所以 NSAIDs 的应用会产生胃肠道反应，尤其是在长期使用时，容易发生不良反应[33]。半数以上 19 世纪 70 年代的 NSAIDs 药物都已经因巨大的副作用退出市场，而布洛芬经受住了新药物的竞争和心血管疾病等副作用的考验，一直活跃在临床上[34]，而且在临床炎性痛镇痛方面一直被广泛使用，所以本实验中使用布洛芬作为阳性对照药物。根据布洛芬在使用后 1-2 小时达到最大血药浓度[33]，在本实验中使用腹腔注射 90 mg/kg 作为实验剂量，福尔马林溶液注射前 1 小时给予。
福尔马林从 1977 年开始应用于实验性疼痛和疼痛过敏[35]，其在疼痛模型中最常被用来诱发炎症性疼痛。福尔马林能够导致两个时相的疼痛，一相痛是由福尔马林直接激活神经末梢疼痛传感器导致，注射后立即发生；二相痛与福尔马林引发的炎症反应以及中枢敏化相关[7,36]。福尔马林在疼痛模型中的浓度一般为 0.5-5%，此前文献中使用的 1%浓度具有典型的疼痛表现和明确的疼痛指标，故本实验也采用了此浓度[37]。本模型的疼痛指标为唇部注射福尔马林同侧前爪或者后爪抓挠炎症部位的时间。
本实验中发现，在福尔马林注射后 3 分钟内有一个疼痛的高峰，即为一相痛，然后经过一个平缓期之后，12-45 分钟疼痛反应迅速增加，即为二相痛。图 1B 中所展示的抓脸时间变化符合福尔马林炎性痛模型的特点，进一步说明本实验中的小鼠颌面部炎性痛模型建立成功，且具有良好的表观效度以及预测效度，为之后的药效学研究和机制探究提供了良好的基础。
.........................
4 结论
CBD 对福尔马林诱导的口腔颌面部炎性痛二相痛具有良好的镇痛效果，其机制可能与下调局部损伤组织炎性因子表达和提高 eCB 含量、以及抑制疼痛信号上行传导有关，并可能通过作用于 CB1R 发挥镇痛作用，提示 CBD 可能具有成为治疗口腔颌面部炎性痛镇痛的药物的潜力。
参考文献（略）