口腔白斑好鳞癌中PCNA、p27、PTEN基因的表现

前言

近年来我国口腔黏膜病科的就诊疾病谱发生了明显的改变，口腔癌前病变及癌前状态所占病例相比以往有了较大幅度增加。根据 WHO 定义，口腔癌前病变是指一种已有形态学上改变的组织，它较其外观相对正常的组织具有更大的发癌可能，癌前病变疾病包括口腔白斑、红斑等；而癌前状态是指一种显著增加发癌危险的一般状态[1]，包括口腔扁平苔藓、口腔黏膜下纤维性变、盘状红斑狼疮、上皮过角化、先天性角化不良及梅毒、着色性干皮病。关于白斑的癌变率，相关文献的报道不等，最高者甚至达到 50%以上，但一般都认为在 5%以上；临床上的研究发现，10%～20%的上皮异型增生白斑会发展为口腔癌，20%～30%发展成上皮重度异型增生，而这些伴重度异型增生的白斑 43%会发展成口腔癌。而红斑的癌变率则会更高，临床上发现，80%的红斑病例病理切片为侵润癌或原位癌。在口腔癌前状态中糜烂型及萎缩型扁平苔藓癌变率较高，有报道达 10%。口腔癌前损害具有较高的癌变率，国内外的研究发现 90%以上的口腔鳞状细胞癌是由口腔癌前损害发展而来。因此，提高口腔癌前损害的诊疗水平具有重要意义，研究口腔白斑及口腔扁平苔藓的发病机制也成为欧美国家口腔医学界的重点之一。
目前，对口腔癌前损害及口腔癌确诊的金标准仍然是对口腔病变部位的活体检查，但这种检查具有创伤性、不可重复性，患者的依从性也相对较差,且因为切取的病变部位的选择，具有很大的主观性，因而会影响临床对疾病的正确诊断、治疗及预后评估。此外，这种标准缺乏能特异性反映癌前损害全身状况的指标，因此，需要开发一种无创、敏感、可重复的诊断方法，如癌变标志物。迄今为止，研究发表的口腔癌前标记物主要有：P53、增殖细胞核抗原（PCNA）、Fas、Fasl、内皮素 1、p16、bcl-2、ATM、人端粒酶逆转录酶等。除此之外，周曾同等[2]通过基因芯片技术还发现了 30 多个与口腔白斑有关的可疑致癌基因。
研究发现 PCNA、p27、PTEN 基因表达的蛋白皆为细胞周期的调节蛋白，与其他细胞周期调节因子相互作用，共同调控细胞周期，维持正常细胞分裂、增殖的平衡。当 PCNA、p27、PTEN 发生基因突变或缺失导致其蛋白表达异常，其对细胞周期的调节平衡被打破，细胞分裂增殖异常。因此，在口腔癌前病变及口腔鳞状细胞癌组织中，PCNA、p27、PTEN 有可能通过相似的机制导致口腔癌的发生。Kato 等[3]在口腔鳞状细胞癌的研究中发现，PCNA 蛋白在大部分鳞癌组织中高表达；PCNA 蛋白高表达的鳞癌患者临床上术后易复发，愈后不良。卢子正等[4]研究也发现在口腔正常黏膜中 PCNA 蛋白染色为阳性；白斑单纯增生时，PCNA蛋白阳性表达主要集中于基底层，呈连续性分布；随着病变程度的加重，白斑伴上皮异常增生时，PCNA 阳性细胞数量增多并扩展至棘细胞浅层；在口腔鳞状细胞癌中，PCNA阳性细胞主要沿癌巢周边分布，而癌巢中央及角化珠阳性比例较少。对 p27 蛋白的研究，Kudo 等[5]用免疫组化方法检测口腔正常黏膜、口腔黏膜单纯增生及口腔鳞状细胞癌组织中 p27 蛋白的表达情况，口腔正常黏膜及单纯增生组织中 p27 蛋白高表达，而口腔鳞癌组织中 p27 蛋白的表达则相对减少，口腔鳞癌伴淋巴转移的，p27 蛋白表达减少更明显，口腔鳞状细胞癌伴淋巴转移与原发性口腔鳞状细胞癌组织中的 p27 蛋白表达差异有显著意义，该研究发现肿瘤的恶性程度越高，p27 蛋白表达减少得越明显。而 PTEN 蛋白表达方面，Cristiane[6]等研究发现在口腔鳞状细胞癌中，45.5%肿瘤整体表达阳性，22.7%的病例组织部分表达阳性，部分阴性，而 31.8%病例整体表达阴性。PTEN 蛋白在分化好的口腔癌中阳性率为 59.1%，而分化差的阳性率为 40.9%，PTEN 蛋白的表达与肿瘤的分化程度相关，侵袭性高、恶性程度高的病例 PTEN 蛋白不表达。
除了对这三个基因蛋白表达情况的单独研究外，许多学者也对这三个基因蛋白表达的相关性进行了研究。王雪等[7]研究发现 PCNA、p27 蛋白在口腔正常粘膜、口腔异常增生组织中的表达与在口腔鳞状细胞癌中的表达具有显著差异，PCNA蛋白与 p27 蛋白在口腔鳞状细胞癌中的表达呈负相关。而对于 PCNA 蛋白与 PTEN蛋白表达的相关性研究，在全身其他部位肿瘤中的研究较多，Hu 等[8]在肝癌组织中发现 PTEN 蛋白表达下调与 PCNA 蛋白表达上调具有相关性。PTEN 和 p27 蛋白在细胞周期中的作用都是通过抑制细胞周期蛋白的活性，抑制细胞增殖。Mamillapalli 等[9]研究发现 PTEN 蛋白表达明显上调 p27 的蛋白表达，而周传香等[10]发现口腔正常粘膜和白斑不伴上皮异常增生组织中 PTEN 和 p27 蛋白阳性表达率为 100%；白斑伴上皮异常增生组织中 PTEN 和 p27 蛋白的阳性表达率分别为93.3%、73.3%。口腔鳞状细胞癌组织中 PTEN 蛋白阳性表达率为 71.9%，口腔鳞状细胞癌组织中 p27 蛋白的阳性表达率为 40.6%，PTEN 蛋白与 p27 蛋白表达在口腔鳞状细胞癌中正相关。以上的这些研究皆表明 PCNA、p27、PTEN 共同在口腔癌前病变及鳞癌的发生发展中起到一定作用。
对口腔癌前损害可疑癌基因的研究，能为临床上诊断和治疗提供分子学的依据，而口腔黏膜癌前病变是癌化学预防的适宜阶段，许多学者致力于研发治疗癌前病变的药物，中医药类的口服药物主要有芪蓝颗粒、绞股蓝等；外用药剂有维甲酸类化合物等。动物实验研究发现芪蓝颗粒及绞股蓝主要都是通过影响癌基因或抑癌基因相关蛋白的表达而起抑癌、阻癌作用。周曾同等[11]将绞股蓝应用于阻断Salley 法诱导金地鼠颊囊上皮癌变，发现绞股蓝能推迟白斑的出现时间，降低白斑的出现率，并且能显著降低致癌率。免疫组化方面的研究发现绞股蓝用药组的 PCNA 蛋白和溴脱氧尿嘧啶（BrdU）蛋白的阳性细胞比较率则显著低于未用药组，绞股蓝有效的降低 PCNA 蛋白的表达，从而起到抑癌、阻癌作用。陈作良等[12]研制的芪蓝颗粒主要也是在细胞异常增生阶段通过下调癌基因表达，上调抑癌基因的表达，对细胞异常增殖起抑制作用，从而延迟或者阻滞癌的演进，使上皮异常增生发生率降低；而在癌组织中通过下调表皮生长因子（EGFR）的表达起到抑制癌变发展的作用。在陈作良等人所建立的大鼠舌粘膜癌变模型中，发现 PCNA、p27、EGFR 这三个基因蛋白表达量改变情况：从大鼠正常口腔粘膜、各级异型增生、鳞状细胞癌中，PCNA、EGFR 蛋白阳性表达呈递增趋势，p27蛋白阳性表达呈递减趋势。而其所研制的芪蓝颗粒作用于大鼠舌黏膜癌变模型，则显著改变了这几个蛋白的表达情况，大鼠异常增生舌组织中未用药组的 PCNA和 EGFR 蛋白表达高于芪蓝颗粒干预组各组，未用药组 p27蛋白表达则明显低于芪蓝颗粒干预组各组，说明芪蓝颗粒具有扶正固本及抑癌阻癌的效果。因此，本实验通过研究参与细胞周期调节相关基因的突变及其表达的改变情况，比较PCNA、p27、PTEN 在人口腔正常黏膜、癌前病变、口腔鳞状细胞癌与大鼠舌正常黏膜，异常增生、鳞癌表达情况的异同，探讨其异同点的机制及这几个基因蛋白表达改变的分子机制，为临床监测癌前病变及癌的发生发展提供分子依据，也为临床上更好的治疗癌前病变及预防癌变的发生，同时为芪蓝颗粒应用于临床提供依据。

目录
二、前言 .......................................................5
三、材料与方法 .................................................8
（一）实验材料.................................................8
（二）实验方法.............................................10
四、实验结果 ..........................................13
（一）人实验结果....................................13
（二）大鼠实验结果.......................................31
五、讨论 ......................................................41
（一）口腔黏膜中 PCNA、P27、...............41
（二）大鼠黏膜与人口腔黏膜 ...................42

结论
本文采用了免疫组化二步法检测了 10 例正常口腔黏膜、15 例单纯增生白斑、10 例不典型增生白斑、20 例口腔鳞状细胞癌组织中 PCNA、p27 蛋白、PTEN 蛋白的表达，并检测大鼠癌变模型中 10 例正常口腔黏膜、10 例单纯增生粘膜、15例不典型增生粘膜、15 例口腔鳞状细胞癌中 PCNA 蛋白、p27 蛋白的表达情况。
实验结果表明：从口腔癌前病变到口腔鳞状细胞癌组织，PCNA 蛋白的表达呈逐渐上升趋势，且经统计学分析发现单纯增生白斑、口腔白斑不典型增生、口腔鳞癌中蛋白表达量增加差异具有统计学意义，说明在口腔粘膜癌变过程中 PCNA 蛋白对细胞增殖的正调节功能亢进，从而加速了细胞增殖，最后导致细胞无限增殖，肿瘤发生。而在口腔单纯增生白斑、口腔白斑不典型增生、口腔鳞癌组织中 p27、PTEN 蛋白表达则呈逐渐下降趋势，统计学分析三者差异具有统计学意义，说明在口腔癌前病变至口腔癌的发生过程中 p27 蛋白、PTEN 蛋白对细胞增殖的负调节功能受到抑制或失去代偿，不能有效的抑制细胞的增殖，因而促使了癌前病变向癌的转变和发展。

参考文献
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