第一章 引言
1.1乳酸菌与发酵食品
发酵食品是指利用微生物或酶加工后的食品，例如奶酪、发酵香肠、泡菜等。我国传统发酵食品种类繁多，蕴含的微生物种类丰富，其中乳酸菌是其中最为重要的微生物类群。
乳酸菌是一类能利用可发酵糖类、能产生大量乳酸、无芽孢的革兰氏阳性细菌的总称，包括了 Lactococcus、Lactobacillus、Enterococcus、Leuconostoc、Streptococcus、Bifidobacterium 等多个属的细菌。乳酸菌在发酵食品制作中扮演着极为重要的角色。首先，在发酵过程中，乳酸菌能迅速产生有机酸、乙醇等，并且很多乳酸菌能合成具有抗菌作用的细菌素，这对于抑制致病致腐菌具有重要意义。其次，乳酸菌能产生一系列重要的酶[2-4]，可促进食品原料的快速利用，而且乳酸菌能合成很多芳香物质，对于食品风味的形成发挥着关键作用。此外，乳酸菌还能产生其他多种功能性成分，如 γ-氨基丁酸、胞外多糖等，有效的提升了发酵食品的营养功能或改进了食品的质地[1]。长期以来，发酵食品中长期使用的乳酸菌被认为是安全的，但是近年研究发现，某些乳酸菌也具有耐药性，而且有的还具有可转移耐药性，极可能引发食品安全问题。因此评价乳酸菌菌株安全性近年来成为国际研究热点。中国的发酵食品种类居全球首位，尤其是中国的传统发酵食品种类繁多，是食品工业和国民经济中的重要组成部分。中国传统发酵食品制造中大多采用自然接种，其次环境和原料中乳酸菌影响着发酵食品的安全性和功能性。在保障乳酸菌安全性的前提下，筛选高产功能物质的乳酸菌具有重要的应用前景。因此，下面分别对乳酸菌耐药性、γ-氨基丁酸和胞外多糖的研究进展作一综述。
1.2 乳酸菌与耐药性
1.2.1 抗生素与微生物的耐药机制
抗生素是一类由微生物产生的具有抑菌或杀菌功能的次级代谢产物。虽然，抗生素的应用为人类治疗疾病做出了重大贡献，但是由于抗生素的过度使用和误用，对环境微生物造成了抗生素选择压力，使得各种耐药性微生物不断涌现，为疾病的治疗带来了挑战。微生物的耐药性产生机制可大致分为四种：
（1）由于基因突变或产生相应的修饰酶导致抗生素作用靶点的改变；
（2）菌体结构改变，如细胞膜渗透性的改变导致药物无法进入细胞；
（3）产生修饰或降解抗生素的酶，使抗生素失效；
（4）通过药物泵将抗生素转移到胞外[5-7]。细菌耐药性大致可分为固有性耐药和获得性耐药两类。固有性耐药一般不会发生转移，如大部分乳酸菌对抗革兰阴性菌的抗生素具有固有耐药性[8]。
获得性耐药大多数是由于抗生素的选择性压力引起的，耐药基因既可由自身基因突变产生，也可从外界获得，后者具有在细菌间水平转移的可能性。耐药性的转移可通过接合、转化及转导三种方式进行[9]。因许多可转移的耐药性基因位于质粒或转座子这类活跃的可移动元件上，且接合作用能使 DNA 跨种界转移，使得接合成为了耐药性水平传递的主要方式。
第二章 实验材料与方法
2.1 实验材料
MRS 培养基：1 %（w/v，下同）蛋白胨，0.5 %酵母提取物，1 %牛肉浸膏，2 %葡萄糖，0.3 %无水乙酸钠，0.2 %柠檬酸三铵，0.2 %磷酸二氢钾，0.01 %无水硫酸镁，0.025%一水硫酸锰，0.1 %吐温 80，pH 6.8。PYG 培养基：在 MRS 的基础上添加 1%的谷氨酸钠（sodium glutamate，MSG）。SDM 培养基[81]：1 %细菌蛋白胨，0.5 %酵母氮源，2 %乳糖，0.5 %无水乙酸钠，0.2 %柠檬酸三铵，0.2 %磷酸二氢钾，0.01 %七水硫酸镁，0.05 %硫酸锰，0.1 %吐温 80，pH 6.8。LSM 培养基：90 %为 Isosensitest（OXOID），10 %为 MRS，混合后使用。ALSM 培养基：在 LSM 的基础上添加如下浓度的抗生素，四环素 0.25-512 mg/L，红霉素 1-512 mg/L，卡那霉素 1-2048 mg/L，氯霉素 0.25-64 mg/L，环丙沙星 0.5-64 mg/L，克林霉素 0.5-128 mg/L，氨苄青霉素 0.25-64 mg/L。LBN 培养基：在 LSM 的基础上加入 0.02%溴甲酚紫指示剂，50 mg/L 制霉菌素。ALBN 培养基：在 LBN 培养基的基础上添加一定浓度的抗生素，抗生素的添加量依据 EFSA 标准中乳酸菌种属的最高阀值（breakpoint）选取如下：氯霉素 8 mg/L，卡那霉素 512 mg/L，四环素 32 mg/L，环丙沙星 4 mg/L，氨苄青霉素钠 4 mg/L，克林霉素4 mg/L，红霉素 4 mg/L。LB 培养基：1%蛋白胨，0.5%酵母提取物，1%氯化钠，pH 7.0。TSB 培养基：购自美国 BD 公司。BHI 培养基：购自 Biosharp 公司以上培养基制备成固体培养基时需添加 1.5%琼脂粉。
2.1.2 菌株、载体、
引物菌 株 ： Escherichia coli JM109 、 Staphylococcus aureus ATCC25923 、 Listeriamonocytogenes NB、Lactobacillus casei LPC-37、Lactococcus Lactis MN256、Streptococcusthermophilus MN168，本实验室保藏。质粒载体：pMD19-T Simple Vector，购自宝生物工程（大连）有限公司。引物：本文所有的引物信息详见表 2-1.
第二章 实验材料与方法 ...................................................17-28
2.1 实验材料 ...................................................17-20
2.1.1 培养基................................................... 17
2.1.2 菌株、载体、引物................................................... 17-18
2.1.3 工具酶、试剂及试剂盒 ...................................................18-19
2.1.4 发酵食品及来源................................................... 19
2.1.5 主要仪器 ...................................................19-20
2.2 分子生物学及微生物学的基本操作................................................... 20-22
第三章 结果与讨论 ...................................................28-43
3.1食品中乳酸菌耐药性的初步研究................................................... 28-35
3.1.1发酵食品中耐药乳酸菌的比例统计................................................... 28-29
3.1.2 耐药乳酸菌呈现多重耐药性 ...................................................29-31
3.2食品中产GABA 乳酸菌的筛选...................................................35-39
3.3食品中产EPS 乳酸菌的筛选...................................................39-43
第四章 结论与展望................................................... 43-45
4.1 结论................................................... 43
4.1.1 对11 种食品中含乳酸菌的耐药性分析................................................... 43
4.1.2食品中高产GABA 乳酸菌的筛选...................................................43
4.1.3食品中高产EPS 乳酸菌的筛选...................................................43
4.2 展望................................................... 43-45
结论
首先，统计了 11 种发酵食品中的乳酸菌对 7 种抗生素的耐药比例，发现各种食品中存在不同程度的耐药乳酸菌，且耐药菌的比例与食品原料来源、种类、加工环境及加工方法密切相关。其次，选取从各种发酵食品中分离得到的 14 株耐药菌进一步深入研究，发现多数存在多重耐药能力，且个别菌株对某些抗生素的抗性极强。然后，通过PCR 扩增已知的耐药基因，发现有的菌在质粒和/或染色体上存在耐药基因，而有的菌中不存在这些已知的耐药基因。最后，通过电转化实验证实了分离自以上菌株的一些耐药质粒具备跨种属的水平转移能力。
从 22 种中国传统发酵食品中分离到 257 株乳酸菌，并用纸层析法从中筛选到产 γ-氨基丁酸的乳酸菌 5 株，其中 L. fermentium MT133 产 GABA 的能力最强。经过发酵条件的初步摸索，确定其最佳的条件为：底物 0.25 mol/L，CaCl25 mmol/L，静置发酵 84 h时，最终发酵液中 GABA 浓度可达到 20.57 g/L。最后，对 GABA 合成途径中的关键基因 gadB 进行了序列分析和克隆研究。
通过菌落观察及菌落拉丝法从 257 株乳酸菌中筛选得到能高产 EPS 的乳酸菌。筛选获得 4 株能高产 EPS 的乳酸菌，经 DNA 鉴定其中 1 株为 Leuconostoc mesenteroides、1株为 Lactobacillus plantarum、2 株为 Streptococcus thermophilus。进一步考察了温度和碳源对这些乳酸菌生产 EPS 的影响，发现最适生长温度有利于 EPS 的总量积累，而低温条件（25 ℃）则有利于粘性 EPS 的形成；乳糖有利于 S. thermophilus 和 L. mesenteroides产 EPS，而蔗糖有利于 L. plantarum 产 EPS。乳酸菌 Ln. mesenteroides MT257 的 EPS 产量可达 335 mg/L。