第一章 序论
1.1 甘草资源现状
目前野生资源采挖破坏严重，数量大幅度下降，在 1980~1990 年所收购的甘草中，甲级甘草占 30 %以上，而截至 2003 年只占 5 %[12]。我国从最初鼓励甘草出口转变为控制甘草出口再到现在进口甘草。甘草资源危机已经威胁到中国中药产业和西北地区的生态安全。以我国最大的甘草产区之一新疆为例，1988年甘草分布面积约80万hm2，储量约 100 t。2001 年自治区对甘草资源调查统计，甘草资源面积仅为 61 万 hm2，储量约 50~60 万 t。根据黄明进 2010 年调查[13]发现根据各省区蕴藏量统计结果，粗略估算全国野生甘草蕴藏量不到 50 万 t，人为采挖已严重影响了野生甘草的种群密度。在野生资源量锐减的同时伴随的是生态环境恶化，在宁夏盐池县甘草产区，各类沙丘和浮沙面积已从 1961 年的 18.3 万 hm2上升到现在的 25.33 万 hm2，短短几十年增加了34.52 %，不但沙漠化加剧，草牧场退化也很严重。使野生特色资源植物甘草如同麻黄、发菜等遭到掠夺式采挖，直接造成道地中药材资源量的锐减、地表植被的大面积破坏和土地沙漠化的急剧扩展[14]。甘草是多年生草本植物，生长周期长，更新较慢，一旦受到破坏短时间内难以恢复。如今，甘草遭过量采挖的同时已经严重影响到内蒙古、新疆和甘肃等甘草主要产区的生态环境。
人工栽培是解决甘草问题的最有用的办法，一方面可以缓解野生甘草的需求，另一方面可以给予野生甘草地区充足的时间恢复，近年来人工栽培资源成为药材的主要商品来源。但是栽培甘草仍然无法满足市场需求，其中一个原因是由于国人传统观念对于野生中药材的偏好，认为野生的甘草要好于人工栽培。另外一个重要原因是产量和质量问题，目前我国栽培甘草药材地里蓄积量估计在 25 万 t[13]，大部分人工甘草的有效成分含量与野生甘草相比存在很大的差距，不同地区人工甘草的产量和质量也存在明显差异。人工栽培甘草通常采用育苗 1 年，再移栽种植 1～2 年的生产方式，因此其产量和品质与种苗的质量、植株的生长发育有着复杂而密切的关系[15]。研究发现，一至四年生人工栽培甘草的甘草酸质量分数没有显著差异，平均在 1. 5 %以下，五年生以后质量分数快速升高，甚至平均达到 2 %以上，但再高生长年限也未达到野生甘草平均 4. 43 % 的水平[16]。延长栽培年限对提高人工甘草药材质量有一定的作用，但若在经济效益角度来看，成本提高了从而效益降低了。因此在适当栽培周期开展栽培甘草的人工干预以提高甘草药材质量，是当前人工甘草栽培技术研究的重点与热点。
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1.2 提高栽培药用植物品质的途径
目前关于环境胁迫促进药用植物次生代谢产物积累的研究成果有很多，有研究发现干旱条件对其他植物如喜树的喜树碱含量明显升高[19]，Tang 等发现，万寿菊在水分胁迫条件下，酚类物质的含量明显高于其在水分充足时[20]。周应群等研究发现随着土壤相对含水量的递减，甘草生物量分配较多地流向根部，使根冠比明显增大[21]。廖建雄等研究表明，适当的干旱胁迫有利于提高甘草中的甘草酸含量[22]；刘长利等也发现干旱胁迫有利于甘草苷的合成积累[23]；刘艳等研究发现，适度干旱使茉莉酸（JA）大量积累，JA 进而诱导下游次生代谢途径活化，次生代谢产物积累，又有利于甘草有效成分的积累[24]。杜茜研究表明栽培甘草如果主要以收获药材为目的，只有控制土壤水分在 12 %以下，才能保证甘草药材的品质[25]。唐晓敏等研究盐分胁迫对甘草药材质量的影响，发现盐胁迫植株除多糖外，甘草酸、甘草苷、总黄酮、总皂苷含量均高于对照组。盐胁迫下甘草酸和甘草苷含量与可溶性糖、淀粉、β-香树脂醇含量表现为负相关关系[26]。还有很多研究表明植物受到生物胁迫时，其次生代谢产物积累有明显的变化。苜蓿叶感染茎点酶后芒柄花素苷和苜蓿素的积累增加[27]，魏明等研究表明真菌能促进石斛生长和有效成分的积累[28]，丁小丽研究发现一些内生真菌与丹酚酸B、咖啡酸等几种有效成分的含量极显著相关[29]。左应梅等用枯草芽孢杆菌、哈茨木霉、德根贝等微生物菌剂处理三七植株，发现德根贝在一定浓度对三七生长发育、产量及质量等方面均有显著促进作用[30]。适当的生物胁迫不仅可以促进药用植物的生长，而且还可增强含有宿主的植物抗病虫侵害以及对逆境的适应能力。
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第二章 MeJA 对甘草有效成分积累的调控
在植物遇到生物或非生物胁迫时，茉莉酸（酯）类物质就会作为内源信号分子参与其抗逆反应。当植物在生长发育过程中遭受细菌、真菌、病毒和害虫等生物胁迫时，其体内就会分别发生 SA、JA 和乙烯等内源激素调控的应答反应[71]。当植物受到以干旱胁迫为主的非生物胁迫时，内源 JA 含量的增加是快速、瞬时的，随着胁迫时间的延长逐渐降低到基础水平。JA 通过调节植物气孔，调控干旱胁迫的关键基因表达，从而提高植物抗旱性和促进次生代谢产物合成与积累，并且部分植物次生代谢产物能作为调节物质进一步提高植物抗逆性[72]。外源应用 MeJA 能够产生与生物和非生物胁迫相似的效果，激发防御植物基因的表达，诱导植物的次生代谢产物合成和积累，这可应用于提人工高甘草次生代谢产物。王学勇与李明等研究均外施 MeJA 诱导丹参，分别发现丹参毛状根和叶片的次生代谢产物含量提高[73、74]。本章实验通过施加 MeJA，测定甘草有效成分含量的变化，考察其对甘草次生代谢产物积累的调控。
2.1 材料与仪器
2.1.1 植物材料
本章节使用试剂及仪器分别见表 2-1 和表 2-2。
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2.2 方法
2.2.1 甘草的栽培
试验在广东药科大学大学城校区药圃内进行，挑选绿色饱满的甘草种子并置于自来水中浸泡过夜，于 2014 年 3 月播种于培养基质为营养土：沙土：本地土=2:2:1 的花盆中。待甘草苗长至 5 cm 后移栽于同样培养基质的花盆中，每个花盆移栽两株甘草，并置于阳光充足透风的地方栽培，定期浇水并进行杀虫灭菌，栽培 6 个月作为试验材料。
2.2.2 MeJA 溶液处理
以乙醇为助溶剂，配制 20、50、100 μmol/L 3 个浓度的 MeJA 溶液。6 月龄的甘草苗作为试验材料，分别喷施浓度为 0、20、50、100 μmol/LMeJA 溶液至溶液布满叶面滴下为止，每 3 天喷施一次，连续处理 3 次，每个样品重复 3 次，第 9 d 采收样品根及根茎，晒干用于甘草有效成分含量测定。
2.2.3 含量测定
取 2.2.3.2 制备的对照品母液进行梯度稀释制备成系列标准溶液，取 10 μL 对照品溶液注入液相色谱仪按 2.2.2.1 的色谱条件进行含量测定。在甘草苷、甘草酸铵保留时间处记录对应的峰面积作为标准曲线的纵坐标(y)，并以对照品浓度为横坐标(x)绘制标准曲线。根据得到的标准曲线（见图 2-1）计算回归方程和相关系数，其中甘草苷：y=16808 x﹣3265.8，R2=0.9998(n=6)；甘草酸铵：y=5261.9 x﹣1132，R2=0.9998 (n=6)。结果表明，甘草苷、甘草酸铵浓度在 5.234~65 μg/ mL 范围内线性关系良好。
取已知浓度的样品按 2.2.3.3 供试品溶液的制备方法同时制备 6 份供试品溶液，并向供试品溶液中加入等浓度等体积的甘草苷、甘草酸铵对照品溶液，混匀后按 2.2.2.1的色谱条件测定。根据加样回收率公式计算加样回收率和 RSD 值：加样回收率(%)=(C-A)/B×100 %，其中 A：样品中所含被测成分含量；B：加入对照品的量；C：加入对照品后所测的的总量。计算得到的甘草苷、甘草酸加样回收率在 95 %~ 101 %之间，证明本方法制备的供试品溶液效果良好。
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第三章 MeJA 对甘草有效成分生物合成相关基因表达的调控.......................16
3.1 材料与仪器.........................................................16
3.1.1 植物材料.....................................................16
第四章 GubAS 全长 cDNA 克隆与表达载体的构建......................25
4.1 材料与仪器.................................................25
4.1.1 植物材料...................................................25
第五章 总结与展望..................................................43
第四章 GubAS 全长 cDNA 克隆与表达载体的构建
甘草酸作为甘草的有效成分之一，属于三萜类化合物。其生物合成主要为甲羟戊酸途径，前期阶段由法呢基焦磷酸聚合生成鲨烯，进一步氧化成 2,3-氧化鲨烯后经 β-香树脂醇合酶（β-AS）催化生成 β-香树脂醇，最后在细胞色素 P450 家族成员的催化作用下生成甘草次酸和甘草酸[91]（图 4-1）。其中，2, 3-氧化鲨烯环化是产生三萜皂苷的重要步骤，由 OSCs 基因家族所催化[92]。β-AS 是 OSCs 家族的一员，是合成 β-香树脂及其下游产物甘草次酸的相关酶，也是产生三萜产物多样性的原因之一，在甘草酸合成途径中起着重要作用。
结合第二章和第三章中 MeJA 对甘草酸及其生物合成途径相关酶 GubAS 基因的调控结果可以得知，中低浓度MeJA溶液诱导甘草一定时间能提高GubAS的表达水平，促进甘草酸的合成和积累。因此本章实验在课题组前期研究获得的转录组数据（Unigene0081362）中 GubAS序列基础上进行克隆，构建 GubAS 阳性重组表达质粒。后续实验中将利用含有pBI-GubAS 的发根农杆菌进行转基因毛状根诱导，和培育转 GubAS 基因植物，研究GubAS 基因功能，为培养甘草优良品质以及利用生物工程技术生产甘草有效成分等奠定基础。
4.1 材料与仪器
4.1.1 植物材料
见第二章 2.1.1。
4.1.2 仪器
除表 4-1，其余仪器同第二章 3.1.4。
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第五章 总结与展望
本研究以 6 月龄甘草为材料，利用不同浓度 MeJA 对甘草处理不同时间，通过考察诱导后甘草的有效成分含量及其生物合成途径相关酶基因表达量变化，探讨 MeJA对甘草次生代谢的调控作用及机制。发现 20、50 μmol/LMeJA 显著促进甘草酸的合成和积累；同时发现 20 μmol/LMeJA 处理甘草 0~6 h、50 μmol/LMeJA 处理甘草 0~2 h 提高 GubAS 的表达量，20 μmol/LMeJA 处理甘草 2~6 h、50 μmol/LMeJA 处理甘草 0~2 h也提高 GubAO 的表达量，随着处理时间延长促进作用逐渐减弱；但是 100 μmol/LMeJA的处理对甘草酸含量和 GubAS、GubAO 表达影响也不显著。对于甘草苷而言，20 μmol/LMeJA 对甘草苷的合成和积累作用不明显，但是随着处理浓度提高出现含量降低的现象。GuDOCS 的表达在 20 μmol/LMeJA 处理 0~6 h 的甘草中有显著提高，随着处理时间延长逐渐恢复至对照组水平；50 、100 μmol/LMeJA 处理对 GuDOCS 的作用不显著，而且随着处理时间延长出现抑制 GuDOCS 表达的现象。因此推断 GubAS 和 GubAO 作为甘草酸生物合成途径下游重要酶基因，中低浓度的 MeJA 对甘草进行短时间处理能促进甘草酸生物合成途径下游酶基因表达，也即通过促进甘草酸生物合成，从而促进甘草酸的合成和积累。而低浓度 MeJA 短时间处理虽然促进 GuDOCS 的表达，但是未体现在促进甘草苷的合成和积累；并且随着 MeJA 浓度提高和处理时间延长，抑制了GuDOCS 表达，影响甘草苷的合成积累进而导致甘草苷含量的降低。
基于 MeJA 诱导甘草中有效成分含量及其生物合成途径重要酶表达量的变化，以及 GubAS 在甘草三萜化合物合成途径中的重要作用。选择 GubAS 进行一系列克隆和表达载体构建实验，成功获得重组质粒 pBI-GubAS。pBI-GubAS 属于植物表达质粒，为后续获得转基因植株或转基因毛状根研究该基因功能和培养甘草优良品种，通过生物工程技术生产药用植物的活性成分，人工手段调控植物次生代谢产物的生产提供依据。
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参考文献（略）