序言
1 研究背景
脑血管病（cerebrovascular disease, CVD）是目前致使人类死亡的 3 大疾病之一，其主要诱发因素有高血压、肥胖、高血脂、糖尿病、心脏病、血小板聚集性高、高尿酸血症等，其中缺血性脑血管病（ischemic cerebrovascular disease, ICVD）在脑血管疾病中的发病率最高，约占 70%-80%[1]。该病有较高的致残率和死亡率，好发人群多为老年人，随着我国人口老龄化的问题日益突出，CVD 的预防和治疗问题越来越受到整个社会的关注[2]。脑缺血再灌注是指脑部缺血一段时间后恢复血液供应，其功能不但未能够恢复，相反却出现了更为严重的脑机能障碍现象，其所造成的损伤称之为脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia reperfusion injury, CIR）[3-4]。脑缺血再灌注损伤是一个非常复杂的动态的生理病理过程，受到很多细胞内外理化及生物活性因素的共同作用和影响，尽管近年脑血管病的诊断和治疗技术已经有很大进展，并能够较大程度地改善和提升患者预后，但是由于绝大部分的患者的病理生理过程无法及时逆转，因此降低缺血性脑损伤的最佳方式还是预防，即针对缺血性脑损伤中的危险因素给予早期干预，减少缺血性脑损伤的发生。
近年来研究发现[5-6]，缺血性脑血管病与血小板功能异常密切相关，血小板活化功能亢进与缺血性脑血管病的关系日益受到广泛的重视。血小板具有参与止血和血栓形成的生理功能，并且在肿瘤转移和动脉粥样硬化等病理生理过程中起到积极作用，这些过程与血小板活化后黏附、聚集和释放等功能密切相关[7]。磷脂酰肌醇 3 激酶（PI3K）是血小板活化过程中的重要细胞内信号传导分子[8]。蛋白激酶 B(Akt/PKB)是 PI3K 下游的重要效应蛋白，PI3K 激活后，Akt 通过它的 PH区域和 PtIns(3,4,5)P3 相互作用从而定位到血浆中的膜表面上，进而使苏氨酸和丝氨酸磷酸化位点磷酸化（Akt-1,Thr308/Ser473;Akt-2,Thr309/Ser474），因此 Akt 的磷酸化是PI3K/Akt 信号通路激活的重要标志[9-10]。
中药复方汤剂具有化学成分天然多样、治疗多靶点的特点，大量的临床观察表明，中药复方汤剂对缺血性脑血管病有较好的预防和治疗效果。补阳还五汤源于清代名医王清任的《医林改错》，该方由生黄芪、当归尾、赤芍、川芎、桃仁、红花、地龙七味中药组成，是根据元气亏虚，气不能帅血行，引发气滞血瘀的证候而创制的补气活血通络方。补阳还五汤具有补气、活血、通络的功效，临床上广泛用于预防和治疗冠心病、缺血性脑血管病、心肌梗塞及其它缺血性脑血管疾病，是目前治疗脑缺血等疾病应用频率最高的方剂之一，具有预防脑缺血再灌注损伤的作用[15]。但其预防和保护的机制，尤其是对分子水平上的细胞信号传导通路方面尚不十分明确。
本课题组前期通过研究补阳还五汤对 PAF 诱导的血小板聚集作用的影响，发现补阳还五汤改善脑缺血模型大鼠脑组织形态、减轻脑缺血组织损伤的机制可能与降低CD40L 含量有关[16]；通过观察补阳还五汤对脊髓损伤（SCI）模型大鼠脊髓组织血小板活化因子受体（PAF-R）mRNA 表达的影响，发现补阳还五汤对损伤脊髓的保护作用可能与其能减少 PAF-R 数目，抑制 PAF-R 活性，从而阻断 PAF 发挥损伤效应有关[17]；通过研究补阳还五汤含药血清对缺氧缺糖（oxygen-glucose deprivation, OGD）损伤的 PC12 细胞形态和活力的影响，发现补阳还五汤含药血清对 OGD 损伤的 PC12 细胞的形态和活力具有保护作用[18]；通过探讨补阳还五汤对急性脑缺血再灌注大鼠第10 号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物基因（PTEN）mRNA 表达与血小板活化的影响，发现补阳还五汤对急性脑缺血再灌注损伤模型大鼠的保护作用机制可能与下调 PTEN 基因表达及抑制 CD62P 表达有关[19]。
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实验部分
1 材料与方法
1.1 实验动物与饲养条件
SPF 级雄性 SD 大鼠 100 只，体重 250-300 g，由广州中医药大学(大学城)实验动物中心提供（许可证号:SCXK(粤)2013-0020），SPF 级动物饲养环境由广东药学院实验动物中心提供（许可证号：SYXK(粤)2012-0125）。饲养室内温度保持在 23-27℃，噪音≤60dB，相对湿度 40％-60％，昼夜温差≤2℃，昼夜明暗交替时间 12 小时/12 小时，饲养室每天紫外灯照射杀菌 2 小时。实验动物饮用水为高压灭菌的纯净水，每天更新一次；垫料为高压灭菌的混合型木屑，每 3 天更换一次；饲养笼经高温高压灭菌，每周更换一次。
1.2 主要药物、试剂与仪器
1.2.1 主要药物
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2 实验方法
2.1 实验动物、分组
将实验大鼠用随机数字表法随机分成 5 组，每组 20 只：假手术（10 mL﹒kg-1蒸馏水）组、模型（10 mL﹒kg-1蒸馏水）组、阳性（6.8 mg﹒kg-1）组、补阳还五汤高剂量（26 g﹒kg-1）组、补阳还五汤低剂量（13 g﹒kg-1）组。适应性饲养 1 周后开始灌胃给药，每天给药 1 次，持续 14 天后禁食不禁水 12 小时，末次给药 2 小时后，复制 MCAO 再灌注模型。假手术组暴露左侧颈部血管，不进行栓塞处理。
2.2 局灶性脑缺血再灌注模型复制与评价
末次给予药物 2 小时后，用 4%水合氯醛（3 mL﹒kg-1）进行左下方腹腔注射，麻醉，仰卧位固定。取栓线，以酒精清洗后置于无菌生理盐水中备用。参照文献[20]方法于 SD 雄性大鼠颈部正中线偏左纵向切口，分离左侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）、颈内动脉（ICA）。结扎 ECA 的分支枕动脉、咽升动脉、甲状腺上动脉等，结扎 ECA 并将 ECA 拉直，使其与 ICA 基本成一条直线，将 CCA 打一活结（以便于再灌注时打开），使直径约 0.26mm 的线栓通过 CCA 分叉部进入 ICA，插入深度约为2cm，使得栓线经过大脑中动脉（MCA）起始端至大脑前动脉(ACA)近端，有阻力感时停止插线，这样就阻断了一次 MCA 的血流供应（MCAO），用动脉夹夹闭 ICA 切口和栓线，1 小时后抽出栓线，再灌注 6 小时，造成 MCAO 再灌注动物模型。假手术组除不插栓线外，其余步骤同上。
整个造模过程中注意实验动物的保温（室温 25℃左右）。待大鼠醒后，观察大鼠的体征，对大鼠神经功能缺失进行评分（评分标准：无神经病学症象为 0 分；提尾时病灶对侧前肢不能完全伸直为 1 分；向瘫痪侧旋转为 2 分；向病灶对侧跌倒为 3 分；无自发活动及意识障碍者为 4 分）。造模成功的标志是大鼠提尾时右肢内收屈曲，爬行时向右侧倾倒或按顺时针方向转圈，不成功者予以剔除。
2.3 检测样本的采取
再灌注 2 小时后，腹主动脉取血 5-10mL，离心分离血清，-80℃超低温冰箱保存备测。大鼠颈椎脱臼处死，取大鼠脑组织以 4℃生理盐水冲净残留血液，滤纸吸干，脑组织标本放在 4%多聚甲醛溶液中固定，其它脑组织置于-80℃超低温冰箱保存，用于蛋白检测。
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3 结果 .................................................................... 21
3.1 补阳还五汤对局灶性脑缺血损伤预防作用 ..................... 21
3.2 补阳还五汤抑制血小板活化的作用 .............................. 26
4 讨论 ............................................................ 29
4.1 实验动物和实验模型的选择 ........................................ 29
4.2 补阳还五汤改善脑缺血再灌注损伤的中医学理论基础 ................... 30
5 不足之处与进一步研究思路 ...................................... 35
4 讨论
4.1 实验动物和实验模型的选择
在动物种类选择上，大鼠具有同系之间遗传差异性小、脑动脉的生理解剖结构与人类近似、神经系统发达、成本低廉、抗感染及手术耐受性强、生命力旺盛等优点。此外，有文献报道雌激素对缺血脑组织具有保护作用[21]，故本实验只选用雄性大鼠。
在各种缺血性脑血管病中，大脑中动脉是缺血性脑血管病的多发区。大脑中动脉栓塞的制备方法大体分为不开颅与开颅两种。不开颅方法包括化学刺激导致血栓闭塞法、光化学诱导血栓形成法、栓子栓塞法、内皮素灌注诱导法等；开颅方法主要包括经过颞下、眶后、眶部入颅三种途径，通过电凝、夹闭、结扎等方法来阻断血流[22]，另外还包括皮层压迫法和微囊导管法。以上方法缺点主要集中在栓塞部位不固定、模型制作难度高两方面，仍待进一步完善。目前线栓法制备大鼠 MCAO 模型应用最广泛。1986 年，Koizumi J[23]发明了线栓法制备局灶性脑缺血大鼠模型。1989 年，Longa[24]在 Koizumi j 的基础上进行改进，发明了不开颅制备大鼠 MCA 阻断模型方法。线栓法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型的优点是：（1）术后成活率高，并发症较少；（2）不需开颅，避免颅内环境变化所造成的影响；（3）脑缺血部位相对恒定，可以模拟人类短暂性和永久性的局灶性脑缺血的不同状态[25]。故本实验采用线栓法制备大脑中动脉局灶性缺血再灌注动物模型的方法来研究补阳还五汤对脑缺血疾病的作用机理。
线栓法制备大鼠 MCAO 模型在制作过程中无法直视，所以对模型是否制备成功的评价非常必要。本实验采用 Longa[24]的造模及评价方法，基本符合预期实验目的。各组造模大鼠苏醒后，表现出不同程度的对侧肢体无力，行走时向对侧倾斜，提尾时对侧前肢不能伸直，身体无法正常卷曲，这些神经功能缺失的体征都说明了模型大鼠的神经功能受到损害；而病理结果可见神经细胞核固缩、间隙增大、神经细胞坏死等脑缺血损伤的病理变化，这从病理形态学的角度证实了模型复制成功；造模后各组间神经功能损伤评分较一致，也说明了实验动物模型成功复制，符合实验预期要求。本研究中动物模型的脑缺血和再灌注时间是在前期反复预实验和参考文献[26-27]的基础上所确定的。预实验的结果表明，在脑缺血 1 小时，再灌注 6 小时的情况下，大鼠脑损伤明显，且死亡率相对在可控范围之内，本课题组在前期的急性脑缺血实验中也对此时间点做了充分验证[14]。
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6 结论
本研究通过大鼠右侧大脑中动脉线栓法复制局灶性脑缺血再灌注损伤模型，在进一步验证补阳还五汤预处理对脑缺血再灌注大鼠神经功能保护作用的基础上，通过对血清中血小板活化标志物 PAF、CD40L、CD62P 以及缺血侧海马组织中 p-Akt、Akt蛋白表达水平的检测，发现补阳还五汤预处理可以有效抑制血小板活化、上调 p-Akt的表达，提示补阳还五汤对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑组织具有一定的保护作用，其机制可能与抑制血小板活化和上调 p-Akt 的表达，从而激活 PI3K/Akt 信号通路有关。因此，调控 p-Akt 的表达情况有可能是补阳还五汤预防局灶性脑血管病的新靶点，这为补阳还五汤预防缺血性脑血管疾病提供了新的实验依据。
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参考文献（略）