前 言
RA 的发病除了自身免疫力过强外，还与环境因素、细菌、病毒等外在条件共同作用有关。关于 RA 的基础研究也十分火热，其中通过建立 RA 大鼠模型，给予西药、中西药结合治疗的文献报道很多，如给予免疫抑制药甲氨蝶呤、雷公藤等，能较好地缓解疼痛症状，降低 RA 大鼠的致炎因子的水平。RA 大鼠模型的建立，一直以来是众多学者研究的热点，有佐剂性模型（AA）、胶原性模型（CIA）等等，虽然这些模型能很好地研究 RA，但也存在缺点。如佐剂性关节炎大鼠，AA 大鼠踝部关节病理切片光镜下可见大量炎性细胞浸润，但滑膜增生和软骨破坏则不明显，AA 缺少慢性病理过程，且在免疫学特点及病理学特征和人类 RA 有着一定的种属差异，病程有自限性。CIA 关节炎发病率高于 AA，该模型大鼠滑膜增生及软骨破坏等继发性病变特征更为明显，从滑膜炎到血管翳，从边缘到关节软骨的破坏，病变持续时间较长。 CIA 不仅有类似 RA 的急性病变特点，还存在一定的慢性病理特征，且操作简单，多数学者认为 CIA 更接近理想 RA。为了更好地接近人类 RA 的致病过程，又有学者提出病证模型，即在原来 CIA的基础上，施加人工环境因素（风寒湿与风湿热）刺激而建立的大鼠模型，此风寒湿痹和风湿热痹证 RA 大鼠能更好地反映人类 RA 的情况，所以将病和证结合，制作出较为理想的 RA 模型。
同时，采用高效液相色谱法对秦艽不同药对特征图谱进行研究，初步阐释秦艽不同配伍水煎液中指标性化学成分龙胆苦苷、獐牙菜苦苷的峰面积变化及配伍对秦艽特征图谱的影响。通过药效及特征图谱的研究，为探讨秦艽抗风湿机理及与有效成分之间的关联性提供实验依据。通过查阅文献，发现前人在研究 RA 大鼠模型时，得出实验室指标如血常规、血沉的数据甚少，本人通过这方面的实验，补充病证结合 RA 模型大鼠的血常规和血沉的数据，为 RA 的基础研究提供实验数据。
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第一部分 实验研究
采用高效液相色谱法对秦艽不同药对特征图谱进行研究，初步阐释秦艽不同配伍水煎液中指标性化学成分龙胆苦苷、獐牙菜苦苷的峰面积变化及配伍对秦艽特征图谱的影响。通过药效及特征图谱的研究，为探讨秦艽抗风湿机理及与有效成分之间的关联性提供实验依据。
第一节 药效学实验
1 病证结合风寒湿痹 RA 大鼠模型的建立
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物
SPF 级 SD 大鼠，40 只，雌雄各半，体质量（200±20） g，由甘肃中医药大学动物实验中心提供。实验动物生产合格证号：SCXK[甘]2011-0001。实验动物使用许可证号：SYXK（甘）2011-0001。
1.1.2 实验药品及试剂
天然牛Ⅱ型胶原（Solarbio，批号 1122D052 ）
完全弗氏佐剂（CFA）（Sigma-aldrich，批号 SLBJ2845V）
冰醋酸（Solarbio，质量体积分数 98.5%）
1.1.3 实验仪器与设备
BS-110S 型电子分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）
HH-W600S 型恒温水浴锅（金坛市大地自动化仪器厂）
YC-E430 型艺术型超声波加湿器（北京亚都科技股份有限公司）
XDZ03A 型野战气象仪器（长春气象仪器研究所）
自制简易封闭造模箱：用直径 0.3cm 的铁丝制作长 110cm×宽 80cm×高 90cm 的无底面长方体，在长方体的外面覆盖一层透明塑料膜，将电风扇、温度湿度计、野战气象仪器放入造模箱中；风寒湿痹组造模箱中置冰水混合液；风湿热痹组造模箱中置恒温水浴装置。
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2 秦艽不同配伍药对对风寒湿痹 RA 模型大鼠一般状态及体重的影响
2.1 实验材料
2.1.1 实验动物
SPF 级 SD 大鼠 80 只，雌雄各半，6 周龄，体质量（150 ±20）g，由甘肃中医药大学动物实验中心提供。实验动物生产合格证号：SCXK[甘]2011-0001。实验动物使用许可证号：SYXK（甘）2011-0001。
2.1.2 试剂及药材
天然牛Ⅱ型胶原（Solarbio，批号 1122D053）
弗氏完全佐剂（西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司，批号 SLBK1731V）
雷公藤多苷片（湖南协力药业有限公司 ，批号 20130103）
野生秦艽、威灵仙、桑寄生、防己药材(中药饮片均购自兰州惠仁堂药店，由甘肃中医药大学中药鉴定教研室李成义教授鉴定)
2.1.3 主要仪器与设备
BS-110S 型电子分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司，型号 BS-110S），数显游标卡尺（上海申韩量具有限公司 ，型号 0-150mm），改装的全自动人工气候箱（RXZ型智能人工气候培养箱，江南制造总局，型号 RXZ-380A-LED，在全自动人工气候箱内安装 3 个风扇，用于模拟自然环境中风的刺激，风速可达 5m/s）(备注：鉴于前期自制造模箱费工费时，且不稳定，故改用人工智能气候箱) 。
2.2 实验方法
2.2.1 胶原乳剂的制备
精密吸取 0.3 mL 98.5%的冰醋酸于 50 mL 容量瓶中，用注射用水稀释、定容，摇匀，即得 0.1 mol/L 的醋酸溶液。精密称取 5 mg 牛Ⅱ型胶原蛋白粉末，置于 25mL 容量瓶中，用 0.1 mol/L 醋酸溶液溶解，在冰水浴中稀释、定容，摇匀，即得Ⅱ型胶原溶液，置于 4 ℃冰箱中过夜。将 25 mL Ⅱ型胶原溶液与冷的 CFA 等体积混合，在冰浴中充分搅拌乳化，所得的胶原乳剂最终质量浓度为 0.1 mg/mL。
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3 HPLC 法分析秦艽-防己配伍前后指标性成分的变化 ............ 43
3.1 仪器与试药 ............................................ 43
3.2 方法 ...................................................... 43
3.3 结果 ...................................................... 46
3.4 讨论 ................................................... 47
第二部分 讨论 ................................................. 48
第三部分 结语 .................................................. 50
第二部分 讨论
在本研究中，通过Ⅱ型胶原诱导与风寒湿刺激，成功地复制风寒湿痹 RA 模型大鼠。通过测定足跖肿胀度、关节炎指数评分、大鼠一般情况（毛发、饮水、摄食、活动度等）、血清指标 IgG 含量、LDH 活性等指标进行综合评价。结果显示，和空白组比较，病证模型组大鼠足跖明显肿胀，关节炎评分指数较高，大鼠毛发稀疏。其中风寒湿组饮水减少，摄食减少，萎靡不振；风湿热组饮水增加，摄食增加，活跃，躁动不安。出现不同的现象，说明接受风寒湿刺激的大鼠机体能量代谢减慢，而接受风湿热刺激的大鼠能量代谢加快，这可以从 LDH 的活性变化可以得知，而且实验测定两组病证模型组的 LDH活性前者升高，后者降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。两种病证模型组的大鼠IgG 均较空白组升高，差异具有统计学意义（P＜0.05），说明两者都是受到了外界抗原刺激后，机体产生免疫效应，并且环境因素可能对 RA 大鼠的发生和进程有影响。实验中，首先进行了预实验，即摸索出风寒湿和风湿热的人工环境：风寒湿环境中温度为 0～4℃，湿度为 80%～99%，风速 4 m/s，每次 30 min；风湿热环境中温度为 35～37 ℃，湿度为 80%～99%，风速 4 m/s。鉴于自制造模箱不稳定，正式实验中采用改装的人工气候箱，即将风寒湿环境中温度设定 4℃，湿度≥95%，风力 5m/s,发现风寒湿痹 RA 大鼠模型能成功稳定复制出来。
经过关节炎指数评分、大鼠体质量变化、大鼠血常规、血沉指标等进行综合评价。与病证模型组比较，各治疗组关节炎指数评分均降低，差异均具有统计学意义（P＜0.05 或 P＜0.01），从血常规相关指标来看，尤以白细胞系统变化显著，即模型组（CⅡ）和病证模型组的白细胞、血小板较空白组有减少趋势，这与人类的 Felty 综合征有相似的地方。这提示当机体受到外源性抗原刺激时，机体产生免疫效应，白细胞具有吞噬功能和特异免疫作用，将机体因炎症反应产生的抗原-抗体复合物吞噬而清除，白细胞的变化能反映出机体的疾病的进展和改善情况。当白细胞减少时，机体可能免疫能力较弱，无法有足够的免疫细胞对抗疾病的侵扰，而各模型组因受到外源性抗原刺激，出现了类似于 Felty 综合征，白细胞的数量有不同程度的降低；给予药物治疗后，Felty 综合征的情况得到改善，白细胞的数量有不同程度的回升，一定程度上缓解了疾病的侵扰以及疾病的进程。实验结果也得出，RA 模型大鼠也出现贫血，而且病证模型组的贫血较模型组（CⅡ）较重，提示环境因素可能对 RA 大鼠伴贫血有促进作用，同时也得出RA 模型大鼠与人类患 RA 伴慢性病性贫血是相似的。
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第三部分 结语
1.Ⅱ型胶原诱导加环境因素刺激能够复制风寒湿痹 RA 大鼠模型，一定程度上能模拟出中医痹证的特点。
2.秦艽不同药对对风寒湿痹 RA 大鼠能够起到治疗作用，且平温相配的疗效优于平平相配和平寒相配。
3.秦艽不同药对配伍后对指标性成分龙胆苦苷和獐牙菜苦苷的含量变化有影响，同时配伍后的水煎液中秦艽的特征峰的总峰面积增加，秦艽的特征图谱发生显著性变化。
4.通过高效液相色谱法分析得出，秦艽不同药对配伍产生了新的峰，即秦艽不同药对配伍后，其水煎液中化学成分不仅发生了量的变化，还有可能发生了质的变化。具体为：秦艽-威灵仙配伍后可能产生一个新的物质，即在秦艽-威灵仙的水煎液色谱图中 12 号峰所代表的物质，其保留时间为 29.222min，相对峰面积为 0.030；秦艽-桑寄生配伍后可能产生了两个新的物质，即在秦艽-桑寄生的水煎液色谱图中 12,14 号峰所代表的物质，它们的保留时间分别为 29.194min，43.169min，相对峰面积分别为 0.040,0.019；秦艽-防己配伍后可能产生了一个物质，即在秦艽-防己的水煎液色谱图中 17 号峰所代表的物质，它的保留时间为 40.712，相对峰面积分别为 0.010。
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参考文献（略）