前言
核桃与榛子、杏仁、腰果并称“世界四大坚果”。核桃富含脂肪酸、蛋白质、多种矿物质、糖类、酚类等物质，营养价值高，具有滋补健身、防病治病等作用，是一种兼具生态价值、经济价值和社会价值的多功能绿色经济物种。胡桃科植物有 9 属 70 余种，间断地分布在各大洲，绝大多数分布在北半球[2-3]，以亚洲、北美洲和欧洲为主要核桃生产地。我国核桃已有 2000 多年的栽培历史，目前已成为世界第一大核桃生产国，云南核桃栽培面积及产量均居全国第一，其独特的泡核桃（Juglans sigillata）以其优良的品质在市场上有较高的声誉，加强核桃资源开发利用的应用基础研究对于云南核桃产业的健康可持续发展具有重要意义。
随着我国经济快速发展，人们的生活水平和饮食结构不断改变，营养过剩所引发的肥胖和高血脂日益突出，已成为危害人类健康的重要危险因素[4-8]。肥胖的发展常伴随风险高的代谢性疾病，如糖耐量异常、血脂异常、胰岛素抵抗、脂肪肝等[9-11]，这些疾病已被公认为代谢综合征 （MetS）。近年来，由于存在严重的心血管风险，FDA撤回药物西布曲明。寻找无毒副作用或毒副作用小的减肥降脂药，具有重要意义。核桃含有丰富的多酚，如没食子酸、芦丁、对羟基苯甲酸、绿原酸和 3-戊糖苷山萘酚等[12]。药理研究表明，核桃多酚具有抗氧化、降血脂、改善记忆等功效[13-17]。核桃饼粕为核桃压榨核桃油后的副产物，多酚含量丰富，目前核桃饼粕的开发利用主要集中于其蛋白质与多肽，对其多酚的利用报道甚少。
论文系统进行核桃饼粕多酚的提取纯化、抗氧化和降脂作用研究。采用 3T3-L1前脂肪细胞，从细胞水平研究核桃粕多酚调节脂代谢的作用；采用动物模型，从整体水平研究核桃粕多酚对急性高血脂症和谷氨酸钠诱导肥胖小鼠的脂代谢的调节作用；采用 UPLC-ESI-MS 初步分析降脂活性成分，为核桃粕资源的高效开发利用奠定基础。
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第一章 核桃饼粕多酚的提取纯化工艺研究
第一节 响应面法优化核桃饼粕多酚的提取工艺研究
1 材料与仪器
1.1 材料
核桃饼粕：云南汇智源食品有限公司。
1.2 仪器与试剂
仪器：LD-100 高速多功能粉碎机（江苏省宏利电器有限公司）；UV759S 紫外-可见分光光度计（上海精科）；LGJ-10F 循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；HH-S6 电子恒温水浴锅（郑州长城科工贸有限公司）；RE-52A 旋转蒸发仪（郑州长城科工贸有限公司）等。
试剂：福林酚（北京索莱宝科技有限公司），没食子酸（上海同田生物技术股份有限公司）；无水乙醇、无水碳酸钠等均为国产分析纯。
2 实验方法
2.1 试剂配制
没食子酸标准品溶液：精密称取 0.0050g 没食子酸对照品，于 50mL 容量瓶中用蒸馏水溶解并定容至刻度，摇匀，得 100 μg/mL 没食子酸对照品储备液，临用现配。
10%福林酚溶液：用移液管准确吸取 10mL 福林酚试剂于 100mL 容量瓶，加蒸馏水定容，摇匀。临用现配。
7.5%碳酸钠溶液：称取 18.75g 无水碳酸钠加蒸馏水溶解，定容至 250mL。
2.2 没食子酸标准曲线绘制
采用 Folin-Ciocaileu 比色法[21-23]。分别准确移取 1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL 的没食子酸对照品储备液于 10 mL 容量瓶中，用蒸馏水定容，摇匀，得浓度为 10，20，30，40，50 μg/mL 的没食子酸溶液。分别吸取没食子酸溶液 1 mL 于 10 mL 容量瓶中，加入 5 mL10%福林酚试剂，摇匀，5 分钟后加入 4 mL7.5%碳酸钠溶液，摇匀后避光反应1 小时，在 765 nm 处测定吸光度。2.3 核桃饼粕多酚的提取
核桃饼粕粉碎，过 60 目筛。精确称取 0.2000 g 核桃饼粕，按照一定的液固比、温度、乙醇浓度回流提取一定时间，过滤，定容，即样品溶液。
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第二节 核桃饼粕多酚大孔吸附树脂纯化工艺研究
利用本章第一节获得的最佳提取工艺提取得到核桃饼粕多酚提取物，用乙醇沉淀法除去其中的部分多糖和蛋白质，提取物真空浓缩后利用大孔树脂进行初步纯化。根据大孔吸附树脂的静态实验，从吸附能力和解吸能力两方面考虑筛选出适合纯化核桃饼粕多酚的树脂，并对其进行动态吸附特性研究，从上样和洗脱两方面研究大孔树脂分离纯核桃饼粕多酚的工艺参数，为核桃饼粕多酚的分离纯化奠定基础。
1 材料与仪器
1.1 材料
材料：核桃饼粕：云南汇智源食品有限公司；五种大孔吸附树脂（NKA-9、AB-8、D101、X-5、HPD-100）：河北沧州宝恩吸附材料科技有限公司。
1.2 仪器与试剂
试剂：Flin-酚试剂，北京索莱宝科技有限公司；无水乙醇、无水碳酸钠、盐酸等均为国产分析纯试剂。
仪器：UV759S 紫外-可见分光光度计，上海精科；电子分析天平，奥豪斯仪器有限公司等。
2 实验方法
2.1 试剂配制
10%福林酚溶液：准确吸取 10 mL 福林酚试剂于 100mL 容量瓶，蒸馏水定容，摇匀，临用现配。
7.5%碳酸钠溶液：称取 18.75 g 无水碳酸钠，蒸馏水溶解并稀释至 250 mL。
葡萄糖标准溶液：精密称取葡萄糖 20 mg，蒸馏水溶解并定容至 100 mL，摇匀，得 200 μg/mL 葡萄糖标准溶液。
牛血清蛋白标准溶液：精密称取牛血清蛋白 10 mg，蒸馏水溶解并定容至 10 mL，得 1 mg/mL 的蛋白质标准母液。
6％苯酚：称取 6 g 苯酚，蒸馏水溶解并稀释至 100 mL，临用现配。
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第三章 核桃饼粕多酚降脂活性初步研究..............35
第一节 核桃饼粕多酚大孔树脂纯化物对蛋黄乳液诱发的急性高脂血症小鼠的降脂作用研究.......35
1 材料与仪器...................................................35
第四章 核桃饼粕多酚大孔树脂纯化物的 UPLC-ESI-MS 分析........61
1 材料与仪器 ............................................61
1.1 材料.................................................61
第五章 总结..........................................72
讨论
血清中 TC 和 TG 水平明显的升高，意味着血脂紊乱的相关疾病的发生的机率大大增加[81-82]。腹腔注射蛋黄乳形成的急性模型是动物摄入过多外源性 TC 而形成的血脂升高，能快速形起小鼠高胆固醇血症，可作为研究降脂药物初步筛选方法。也有报道表明，腹腔注射蛋黄乳后小鼠 TG 水平同样显著升高[83]。通过建立小鼠急性高脂血症模型，并用 WMP 进行对抗治疗，显著降低小鼠血清中的 TG 和 TC，结果表明 WMP 具有较好的预防脂质代谢紊乱疗效，其可能是通过加快脂质的转运与排泄。由于腹腔注射蛋黄乳的快速造型方式与人类因饮食造成的高脂血症发病机制存在一定的差异．要阐明其作用机制还需要建立慢性高脂血症模型来进一步研究。
代谢综合征是一系列的代谢及内分泌紊乱的症候群，如：肥胖、胰岛素抵抗、糖耐量受损、高血压以及血脂异常等。多种代谢性疾病的合并出现为代谢综合征的特点。近年来随着社会经济的发展和饮食结构的改变，代谢综合征的发病率和患病率在发达、发展中国家逐年升高，因此，该病的预防和治疗也受到越来越多的关注。谷氨酸钠诱导的肥胖小鼠模型是一种理想的研究代谢综合征的动物模型。3T3-L1 细胞因在一定条件下，经诱导后能分化成为脂肪细胞，被广泛应用于糖脂代谢相关的基础和实验研究，是目前体外研究脂肪细胞分化应用最为广泛的细胞系。很多研究显示，多酚有效地抑制细胞生长和诱导凋亡，如没食子酸、儿茶素等[84-86]，提示其可能具有减肥和降脂的作用。那么核桃饼粕多酚是否可以在细胞水平和整体动物水平上发挥减肥降脂的作用，进而改善代谢综合征的各种并发症呢? 本论文研究结果表明：WMP 显著降低小鼠体重、Lee’s 指数、脂肪指数、TG、TC、LDL-C、葡萄糖以及胰岛素水平值，显著升高 HDL-C 和脂联素水平；显著降低小鼠肝脏中 ALT、AST、MDA、TG、TC 水平值，显著升高 GSH-PX 和 SOD 活性，说明 WMP 可以改善谷氨酸钠干预后小鼠出现的肥胖的糖脂代谢异常以及肝损伤。WMP 显著抑制 3T3-L1 增殖和降低细胞中 TG 和 TC 水平，说明核桃饼粕多酚抑制 3T3-L1 细胞增殖和分化。
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第六章 核桃多酚的研究概况
1 核桃多酚提取与分离
1.1 核桃多酚提取
核桃多酚的提取多采用溶剂提取法，如索氏提取法和水浴提取法，常用溶剂有水、乙醇、甲醇等。近几年采用超声波、微波辅助提取技术和超临界萃取法进行提取，前两者得到广泛应用，后者使用较少。徐宏化等[26]对 29 个美国山核桃种质和脱脂种仁采用 70%乙醇，在 70 水浴回流提取2 h得到总多酚和总黄酮，其中ZL86号种质总多酚含量最高，其为47.96 mg GAE/g；ZL65 号种质总黄酮含量最高，为 24.01 mg RE/g。房祥军[27]采用正交试验法，利用丙酮溶液对山核桃仁中总多酚进行提取工艺的优化，研究结果表明，影响因素大小次序为丙酮浓度>提取次数>提取时间>料液比，山核桃仁总多酚的提取最优工艺条件为提取溶剂为 50%丙酮-水溶液，料液比 1:15，提取时间 1.5 h，提取温度 30 ℃，提取 3 次，在上述条件下测得山核桃仁中总多酚含量 4.71%，平均回收率 96.71%。张春梅等[28]采用乙醇提取核桃内种皮多酚和正交试验进行优化，得到最佳工艺条件为 45%乙醇、液固比 60:1(mL:g）、提取温度 70℃、提取时间 60 min，此最佳工艺下多酚得率为 25.05%。周晔[29]采用响应面法和超声波技术对核桃内种皮酚类物质的提取工艺进行优化，结果表明，0.1 g 核桃内种皮粉末在固定超声波功率 100w 下的最佳提取工艺为提取温度 53℃，提取时间 55 min，液固比 58:1（mL:g），总多酚得率为 30.79％。张淑兰[30-31]采用正交试验法和响应面法分别优化核桃隔膜总黄酮提取工艺，分别以芦丁和木犀草苷为定量指标，结果表明，正交实验法优化得到得最佳提取工艺为 60 目筛的原料加 15 倍量 60%乙醇超声提取，总黄酮提取量为 2.985 mg/g；响应面法优化得到最佳提取工艺为：提取溶剂 57%乙醇，提取时间 30 min，料液比 1:25，此条件放大 5 倍，得到平均总黄酮提取率 7.239%。赵国建[32]利用响应面法对核桃饼粕中原花色素提取进行了工艺优化，结果表明，影响因素由大到小依次为：提取时间>酸度>乙醇体积分数，最佳提取工艺参数为提取时间 83 min、提取溶剂 80%乙醇、酸浓度 0.04 mmol/L，在此条件下核桃饼粕中原花色素的提取率为 18.16 mg/g。本论文的研究表明[33]，核桃饼粕多酚的最佳提取工艺为提取温度 73℃，提取时间 60 min，乙醇浓度 50%，在此提取最佳工艺条件下重复 3 次，得平均多酚的提取量为 6.95%。
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参考文献（略）