第一章 牙膏用美洲大蠊提取物的化学成分研究
1. 前言
蜚蠊目(Blattaria)拥有庞大的昆虫家族，它是世界上生命力最古老、最顽强、至今繁衍最旺盛的昆虫类群之一，在地球上已经存在 3.2 亿年。1960 年，Princis曾实验统计，世界范围内蜚蠊约存在 3500 种[1]，据统计目前全世界的蜚蠊已接近 5000 种，其中我国记载有 253 种[2]，主要分布在带、亚热带地区的露天或田野，美洲大蠊属于个别几种家居蜚蠊品种之一。美洲大蠊（Periplaneta americana L.）为昆虫纲有翅亚纲蜚蠊目蜚蠊科大蠊属昆虫，俗名“蟑螂”，其入药最初记载在《神农本草经》，将其列为中品，味：咸、寒；治：血瘀症、寒热、破积、喉咽闭、内寒无子”[3]。当代药学专著均记叙蜚蠊有“活血、化积、解毒”等功效，可用来治疗蛇虫咬伤、痔疮、痈肿。美洲大蠊作为室内害虫，主要生活于厨房、仓库、食堂等地，损害食物、衣服、书籍等，同时取食并污染食物，传播伤寒、痢疾、蛲虫、蛔虫等疾病。胡修元[4]研究报道室内栖息蜚蠊可能携带的呼吸道与肠道致病细菌约 34 种，霉菌 12种。
美洲大蠊化学成分丰富多样，与自身独特的药理活性相关，引起了中外科学家的广泛兴趣和社会的普遍关注，其市面应用前景特别看好。但是，要开发出的蟑螂产品还存在许多问题，首先是以美洲大蠊为原材料制备的多组分临床药物具有较好的药效，但其对应疗效的物质基础不明；其次这种药物作用的原理与机制并不明确。美洲大蠊因其良好的抗炎、抗溃疡作用，已经制成功能性牙膏上市，获得良好经济效益和社会意义。为更好控制其功能性牙膏质量，阐明其所用原料的物质基础，本课题对“孔雀公主”牌牙膏用美洲大蠊原料进行了物质基础研究，以期建立其牙膏用美洲大蠊提取物质量控制标准，确保牙膏功能性和安全性，并对全面认识美洲大蠊成分及利用开发提供科学支撑。
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2. 实验部分
2.1 美洲大蠊提取物的化学成分研究
2.1.1 仪器与材料
核磁共振谱用氘代试剂，一维和二维核磁共振谱 (1D 和 2D NMR)在DRX-500 超导核磁共振波普仪或 AVANCE Ⅲ-600 超低温探头超导核磁共振波谱仪上测定，δ 表示化学位移 (单位 ppm)，J 表示耦合常数 (单位 Hz)。比旋光度 (ORD) 由 JASCO P-1020 全自动数字旋光仪测定。在 API QSTAR Pulsar i 串联四级杆飞行时间质谱仪上分别测定电喷雾电离质谱 (ESI-MS) 与高分辨电喷雾电离质谱 (HRESI-MS)。
柱层析材料为 RP-C18反相中压柱 (东京理化)，MCI-gel (日本三菱公司)，Sephadex LH-20 (GE Healthcare 公司)，青岛海洋化工生产的柱层析硅胶材料(200-300 目)以及薄层层析硅胶 G 板、薄层层析硅胶 GF254、薄层层析硅胶 H 型。
试剂：氯仿，甲醇，乙酸乙酯，均为分析纯 (天津博迪化工)，蒸馏水 (实验室制备)。
显色剂：0.5 % 茚三酮乙醇溶液，10 % 硫酸乙醇溶液，改良碘化铋钾，碘
2.1.2 分离纯化
美洲大蠊成虫 5 kg，低温粉碎，用 5 倍量的体积分数为 95 %乙醇室温渗滤提取 3 次，每次 24 h，合并渗滤液，减压浓缩称重得总流浸膏约 750 g。浸膏用水 10 L，搅拌混悬，用石油醚萃取 3 次（10 L、5 L、5 L），萃取后水液部分再用 2 %活性炭脱色，减压浓缩干燥得白色粉末混合物 230.7 g。取白色粉末混合物(100 g)，经 RP-C18柱层析，依次用 V甲醇:V水= 0:100 ~ 50:50 梯度洗脱得到 2 个馏分 (A、B)。馏分 A (92 g)，经硅胶柱层析 (V氯仿:V甲醇:V水= 9:1:0.1 ~ 0:0:1) 梯度洗脱得到 5 个组分 (A1-A5)。
A1 (6.8 g) 经反复硅胶柱层析 (V氯仿:V甲醇:V水= 9:1:0.1 ~ 6:4:1) 梯度洗脱得到 A-1-2 (3.8 g)，进一步柱层析 Sephadex LH-20 (V氯仿:V甲醇= 1:1) 和硅胶柱层析(V氯仿:V甲醇:V水= 9:1:0.1 ~ 6:4:1)，最后由薄层硅胶 GF254(V氯仿:V甲醇:V水= 6:4:1)得到化合物 9 (18 mg)、11 (3 mg)。
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第二章 美洲大蠊不同提取工艺的氨基酸含量比较
1.实验材料与方法
实验材料：不同提取工艺的美洲大蠊提取物 1 号与 2 号
其中美洲大蠊提取物 1 号为第一章化学研究提取物白色粉末
测定方法：粗蛋白采用 GB 5009.5-2010；氨基酸采用 GB 5009.124-2003
数据统计分析：采用 Excel 统计分析软处理，比较两组氨基酸含量及进行分析。
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2. 实验结果
两组美洲大蠊提取物蛋白质与氨基酸含量测定结果见表 1
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3. 实验讨论
3.1 蛋白质含量比较
美洲大蠊提取物蛋白质含量较高，1 号和 2 号提取物分别为 38.5%和 48.1%，在蛋白质提取率，1 号提取工艺是 2 号的 80 %
3.2 总氨基酸含量比较
美洲大蠊提取物氨基酸总类丰富，均含有 14 种常见氨基酸，1 号提取物氨基酸总含量为 25.09 %，2 号提取物氨基酸总含量为 25.78 %，2 号比 1 号游离氨基酸总量高 0.69 %，两者含量差异不明显。
3.3 必需氨基酸含量比较
美洲大蠊提取物含有 6 种人体必需氨基酸，包括苏氨酸、赖氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸。1 号提取物必需氨基酸总含量为 6.4 %，2 号提取物必需氨基酸总含量为 2.94 %。在必需氨基酸提取率上，1 号提取工艺是 2 号218%。
1 号提取物必需氨基酸含量高低：缬氨酸＞赖氨酸＞亮氨酸＞苏氨酸＞异亮氨酸＞苯丙氨酸。2 号提取物必需氨基酸含量高低：苏氨酸＞赖氨酸＞苯丙氨酸＞缬氨酸＞亮氨酸＞异亮氨酸。
从氨基酸含量看，几种必需氨基酸在两种美洲大蠊提取物含量差异较大，尤其是亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸差异最为明显。
3.4 非必需氨基酸含量比较
在整体上，两种美洲大蠊提取物非必需氨基酸含量远大于必需氨基酸，而 2号比 1 号非必需氨基酸总量高。1 号提取物非必需氨基酸含量高低：谷氨酸＞丙氨酸＞甘氨酸＞脯氨酸＞组氨酸＞丝氨酸＞天门冬氨酸＞精氨酸。2 号提取物非必需氨基酸含量高低：谷氨酸＞丙氨酸＞甘氨酸＞组氨酸＞丝氨酸＞天门冬氨酸＞精氨酸＞脯氨酸。1、2 号提取物含量最高的三种氨基酸相同，分别是谷氨酸、丙氨酸和甘氨酸。这三种氨基酸含量在 1 号与 2 号分别占总氨基酸的 56.4 %和 66 %，相差 9.6 %，其中谷氨酸含量最高，而甘氨酸在两者含量差异明显。1 号提取物中赖氨酸、脯氨酸含量高于 2 号提取物，2 号提取物苏氨酸、组氨酸、丝氨酸、天门冬氨酸、精氨酸和脯氨酸含量高于 1 号提取物。
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第三章 美洲大蠊的研究进展......................28
1. 引言...................................................28
2. 美洲大蠊现代药理活性研究进展......................28
3. 美洲大蠊的新药研发............................32
4. 美洲大蠊的化学成分.................................34
5. 含量测定方法研究....................................46
6. 化工提取方法比较...................................49
第三章 美洲大蠊的研究进展
第一节 引言
实验表明，康复新液由于抑制蛋白质和 RNA 的合成，促进伤口处胶原的产生和沉淀，增加创伤处白细胞和中性粒细胞的数量，改善中性粒细胞数量的自发运动和趋化性能，加速创伤面的修复[31]，使局部炎性反应渗出减少，从而促进组织修复，且对皮肤具有刺激性小、渗透力强的特点。临床主治体表创伤(烫伤、溃疡、瘘等)；胃和胃初血；十二指肠溃疡及溃疡性结肠炎；空洞型肺结核；非特异性炎症，恶性纤维组织细胞瘤。除以上主治疾病，康复新在以下病症中也具有较好的疗效[32]：胃食管反流病，慢性萎缩性胃炎，放射性食管炎或肠炎，胃黏膜切除术后，门脉高压性胃病。鼻中隔糜烂，顽固性鼻出血，慢性咽炎，扁桃体周围脓肿，小儿手足口病，干槽症，颌骨坏死，头颈部恶性肿瘤，糜烂型胃炎，尖锐湿疣术后创面，宫颈糜烂，宫颈上皮内瘤变，痔疮术后创面，新生儿尿布皮炎，带状疱疹，糖尿病足，挫裂伤，皮肤皲裂[33]。
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第二节 美洲大蠊现代药理活性研究进展
抗菌肽是美洲大蠊中主要抗菌成分，针对不同的诱导源，它会产生不同活性的抗菌物质，借此有效地抑制细菌的生长[9]。杜一民等[10]用鸭乙型肝炎病毒 (DHBV) 静脉注射雏鸭进行造模，对鸭血清DHBV-DNA 采取斑点杂交方法检测，以病毒抑制率作为疗效判断，研究结果表明肝龙胶囊对雏鸭体内的 DHBV-DNA 复制具有抑制作用。王奎[11]采用自制美洲大蠊提取物进行抑菌试验，结果表明美洲大蠊石油醚提取物只对枯草芽孢杆菌表现了抑菌作用；美洲大蠊乙酸乙酯提取物对供试的 G+菌均显示抑菌活性，对枯草芽孢杆菌的抑菌效果最好。
蜚蠊性寒，具备破瘀、消肿、解毒等效应，对婴儿肛周脓肿疗效卓越，且无副作用[12]。肖小芹等报道[13]采用小鼠热板法镇痛及醋酸致小鼠扭体反应两种实验考察美洲大蠊提取物的镇痛效果，采用蛋清致大鼠足跖肿胀和二甲苯致小鼠耳廓肿胀的两种动物模型考察其抗炎作用；初步证明美洲大蠊提取物对炎症引起的组织水肿存在显而易见的消肿作用，也有卓越的镇痛作用。
甘平等[17通过 CCl4和 ConA 建立小鼠急性肝损伤模型，检测血清中 ALT、AST 及肝组织中 SOD、MDA 变化，研究表明美洲大蠊醇提物对 CCl4和 ConA导致的肝损伤存在明显抑制效果。王鹏飞[18]等对小鼠采用一天内 1 次与 2 次灌胃给药，给以最大体积，观察小鼠在 7 天内的体重、行为及死亡等情况；利用腹腔注射 0.2% CCl4油溶液，进行小鼠急性肝损伤造模，最后测定小鼠血液中血清丙氨酸转氨酶，AST 活性和肝重系数。实验显示美洲大蠊油脂无显而易见的急性毒性反应，美洲大蠊油脂对美洲大蠊提取液保护肝损伤的药理作用存在拮抗效果。夏超等[19]对美洲大蠊水提取物进行研究，采用大鼠腹腔注射猪血清制备免疫性肝纤维化模型，以血清中 ALT、LN、AST、PCⅢ、HA、和 CⅣ为标准；取肝脏，对 HE、Masson 染色比较肝组织病理和胶原沉积变化的差异；制备肝脏匀浆，ELISA 法测 SOD 活性和 GSH Px、MDA 的含量；对肝组织中 αSMA、TGFβ1蛋白的表达利用 Westernblot 法和免疫组织化学测试。结果表明该物质对猪血清诱导的免疫性肝纤维化大鼠存在明显的保护效果，自身抗氧化能力和抑制 TGFβ1的表达也许是发挥作用的原因。
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参考文献（略）