引言
随着世界经济的迅速发展，伴随着人民生活方式的改善以及饮食结构的变化，2 型糖尿病（Type 2 DiabetesMellitus，T2MD）的发病率逐年都在上升，研究改善胰岛素抵抗的药物对于治疗代谢综合征相关的疾病具有重大的意义。荜茇是胡椒科植物荜茇的成熟或近成熟的干燥果穗，是藏、蒙、中医习惯用药，临床用于治疗消化不良、食欲不佳、腹部胀痛、泄泻、呕吐等症状[2]。胡椒碱（piperine，PIP）是荜茇这种中药的主要活性成分，属桂皮酞胺类生物碱，广泛存在与自然界中，特别是胡椒科植物大量存在，现代药理学研究发现其具有抗氧化、调节脂代谢、免疫调节、抗癌症、增强生物利用度、有助于药物代谢等作用[3]。
本课题组近些年实验研究已表明，荜茇醇提取物的不同浓度能够降低胰岛素抵抗大鼠模型的空腹血糖水平、血清中游离脂肪酸、血压、可改善糖耐量异常的情况，增强胰岛素敏感指数等关键指标的病理性变化等。细胞方面，前脂肪细胞诱导分化成脂肪细胞已经相对成熟，对脂肪细胞中涉及腺苷酸活化蛋白激酶信号通路相关靶点做了初步研究，为深入开展荜茇的有效成分胡椒碱对胰岛素抵抗糖代谢关键靶点干预作用研究奠定基础。
AMPK 信号通路是不同于胰岛信号信号通路的，首先它参与葡萄糖代谢过程是通过将 GLUT4 向细胞膜转移，其次是磷酸化 AMPK 信号通路来开启 GLUT4 的基因表达。AMPK 在肌肉细胞中被激活时，能提高葡萄糖的摄取能力，同时伴随葡萄糖转运蛋白 4 的位移。而脂肪细胞中，AMPK 的激活同样能增强葡萄糖的转运，并使葡萄糖转运体 4 从细胞内转移至膜上，从而增加葡萄糖的摄取能力，并调节细胞因子 GLUT4 表达水平，可作为其对糖代谢调节的重要依据。
本课题研究主要目的是通过 3T3-L1 脂肪细胞 IR 模型和分化后的 C2C12 成肌细胞，证明了 PIP 对胰岛素抵抗的改善效果是通过 AMPK 这条信号通路实现的，并通过分子生物学技术分析 PIP 对脂肪细胞和肌肉细胞中 AMPKα 和 GLUT4的干预作用，来探索可能作用机制。
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第一章 3T3-L1前脂肪细胞的培养和脂肪细胞IR模型的建立
1 实验材料
1.1 细胞株
3T3-L1 前脂肪细胞株，购于中国科学院昆明动物所，细胞资源中心。
1.2 主要仪器
CO2培养箱(SW-CJ-1F 型)：日本三洋科技有限公司
超净工作台(SW-CJ-1F 型)：苏州安泰空气技术有限公司
倒置荧光显微镜(ECLIPSE TS100)：日本 Nikon 公司
台式离心机(allegraX-22)：美国贝克曼公司
蠕动泵驱动器(WT600-1F)：保定兰革恒流泵有限公司
漩涡混合器（QL-861 型）：江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司
十万分之一电子分析天平(AB265-S)：梅特勒-托利多公司
酶标分析仪（Infinitem200 PRO）：瑞士 Tecan 公司
Milli-Q 超纯水机：美国 Millipore 公司
RO 纯水机：美国 Biogen 公司
摇床（TS-8 型）：江苏其林贝尔仪器公司
恒温水浴锅：北京永光明医疗器械厂
1.3 主要试剂
高糖培养基（DMEM）：Hyclone 公司
中美胎牛血清（FBS）：BI 公司
青霉素-链霉素溶液：Hyclone 公司
胰蛋白酶：Hyclone 公司
乙二胺四乙酸(EDTA)：西安沃尔森公司
磷酸盐缓冲液干粉（PBS）：Solarbio 公司
牛胰岛素：美国 Sigma 公司
地塞米松（DEX）：美国 Sigma 公司
3-异丁基-1 甲基-黄嘌呤（IBMX）：美国 Sigma 公司
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2 实验方法
2.1 3T3-L1 前脂肪细胞的培养
2.1.1 细胞复苏
将 3T3-L1 前脂肪细胞从-196℃液氮中取出，立即放入 37℃水浴锅中进行水浴，水浴时缓缓摇动冻存管使其溶解均匀，解冻 2min 后，细胞冻存液溶解完全，迅速将细胞拿进超净工作台中，用枪头将冻存管中的含细胞冻存液吸出，缓缓滴入已准备好细胞培养液的培养瓶中，标记好细胞复苏日期，细胞代数，放入 CO2培养箱中，待 4 小时后，细胞大多数贴壁时，进行换液，继续培养。
2.1.2 细胞传代培养
当细胞在培养瓶中长至 80％-90％左右时即可进行传代，倒去培养瓶中培养液，延瓶壁加入 2mlPBS 缓冲液充分摇匀，然后倒去，加入含有 EDTA 的胰酶消化液 1ml，使其均匀覆盖瓶底，放入 CO2培养箱 3min 进行消化，待消化完成后加入完全培养基终止消化，并吹打均匀，将瓶中液体倒入离心管中进行离心。离心完后加入适量培养液进行吹打，通过显微镜观察细胞密度，来决定传代密度，分瓶完成后，在培养瓶上标明代数及传代日期后，放入 CO2培养箱继续培养
2.1.3 细胞冻存
观察细胞生长条件和状态选用对数生长期的细胞进行细胞冻存，从 CO2恒温培养箱取出正在培养的细胞，倒去培养瓶中培养液，加入 2ml PBS 缓冲液小心冲洗瓶底，然后弃掉缓冲液，加入 1ml 含 EDTA 的胰蛋白酶细胞消化液，让其均匀覆盖培养瓶底，待 3min 后，80％左右细胞消化下来时，加入含有胎牛血清的完全培养基使其终止消化，并用移液器吹打悬液，并将液体倒入离心管中，进行细胞离心。离心完成，加入刚刚配置好后放入 4℃冰箱的含有 10％DMSO 的胎牛血清，并吹打混匀细胞，根据细胞密度决定冻存多少支。在冻存管上注明冻存细胞的种类，日期以及细胞传代数，放入程序降温盒中过夜，第二天转移至-196℃液氮中进行长期保存。
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第三章 PIP 对 3T3-L1 脂肪细胞 AMPKα，GLUT4 mRNA 和蛋白的影响.......26
1 实验材料.....................................................26
2 实验方法.....................................................27
第四章 PIP 对 C2C12 肌肉细胞糖代谢的改善作用...................41
1 实验材料.....................................................41
2 实验方法.....................................................41
第五章 PIP 对 C2C12 肌肉细胞 AMPKα，GLUT4 mRNA 和蛋白影响......48
1 实验材料..................................................48
2 实验方法....................................................48
讨论
1 研究背景
众所周知，脂肪和肌肉组织是胰岛素的关键靶组织，对糖代谢相关领域的研究具有重要意义。胰岛素抵抗已成为许多代谢类疾病的病理生理基础，以及发病机制的重要环节，为此它受到广泛的关注。AMPK 被看做是一种参与调节多种细胞代谢的蛋白激酶，被称为“能量感受器”[6]，一旦其因为某种应激反应导致AMPK 被激活，它便可以增强葡萄糖的摄取和利用，并产生更多能量，抑制糖原的合成和糖异生以减少能量的消耗，从而使细胞达到一种稳态[7]。AMPK 调节包括肝脏，脂肪，肌肉在内的外周组织的糖代谢过程，本课题选取了典型的脂肪细胞和肌肉细胞进行体外培养，通过建立有效的脂肪细胞模型和成肌细胞来探讨PIP 对于治疗糖代谢紊乱引起的胰岛素抵抗所产生的内在分子机制。课题组近几年的实验研究显示，在动物实验中，荜茇提取物对于改善胰岛素抵抗大鼠模型的葡萄糖水平，胆固醇水平，甘油三酯水平等具有显著效果，在细胞实验中，胡椒碱已被证实对于脂肪细胞 IR 模型，具有降低甘油三酯以及提高葡萄糖消耗量的功效。本研究在前期细胞实验研究的基础上，细化给药浓度和时间点，探索胡椒碱的最佳量效和实效关系，在分子水平上，深入探索 PIP 对 AMPK 信号通路及相关靶点的干预作用，揭示其改善糖代谢紊乱的内在分子机制。
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2 细胞的选择及与 AMPK 信号通路关系
脂肪组织作为胰岛素的重要靶组织之一，是机体能量调节的重要器官[8]，脂肪组织在胰岛素抵抗引起的 2 型糖尿病中起着重要作用，3T3-L1 来源于小鼠胚胎成纤维细胞，在体外实验中被广泛应用于脂肪细胞功能的研究[9]。本实验利用3T3-L1 前脂肪细胞诱导分化为成熟脂肪细胞后，经过地塞米松作用于细胞，建立脂肪细胞 IR 模型。胰岛素抵抗作为 2 型糖尿病主要特征之一，是导致糖代谢紊乱的关键原因，有相关实验研究表明[10]，脂代谢紊乱的时间要先于糖代谢紊乱，将前脂肪细胞诱导分化为成熟脂肪细胞出现脂滴也是造成细胞内脂代谢紊乱的一种表现，本课题前期细胞实验显示，分化后的脂肪细胞内甘油三酯的含量明显高于正常的前脂肪细胞，糖脂代谢的紊乱与胰岛素抵抗关系密切，因此选用该细胞作为研究对象来探索代谢综合征相关疾病可能存在的机制和机理。
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结论与展望
1 结论
在 3T3-L1 脂肪细胞中，PIP 与阳性药罗格列酮一样，通过增加 P-AMPKα蛋白表达来激活 AMPK 信号通路，并调节其下游 GLUT4 的表达水平，达到改善胰岛素抵抗的作用，从而调节糖代谢紊乱。量效关系显示，在 3T3-L1 脂肪细胞中 PIP 10μM 给药浓度为最佳浓度。时效关系表明，AMPKα 在 24h 的药物干预下，表达水平达到峰值。GLUT4 在 12h 时，表达水平最高，并且随着时间的增加，其表达效果呈现出递减趋势。
在 C2C12 肌肉细胞中，PIP 与 ROG 一样，通过增加 P-AMPKα 蛋白表达来激活AMPK信号通路，并且在PIP 10μM浓度干预下AMPKα和GLUT4的mRNA和蛋白表达水平达到峰值，说明该浓度的 PIP 对于 C2C12 肌肉细胞的干预作用最佳，同样通过磷酸化 AMPKα 蛋白来激活该信号通路，来增加 GLUT4 的表达，达到改善糖代谢紊乱的效果。
总之，在 C2C12 肌肉细胞和 3T3-L1 脂肪细胞中，通过 PIP 干预作用下，能够对 AMPK 信号通路以及下游靶点 GLUT4 进行调节，达到改善细胞糖代谢紊乱的效果。
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参考文献（略）