前 言
鞘蕊苏药材主产印度、斯里兰卡、缅甸等热带国家，我国云南、福建、台湾等省亦有少量分布，被植物学家界定为稀有物种。鞘蕊苏在民间用于治疗咳喘疾患，疗效十分显著，称为“神药”，为此湖北福人药业公司将其开发为“鞘蕊苏胶囊”中药新品种[生产批号：2011S00365]。为了解决鞘蕊苏胶囊产业化原料药材的供求问题，湖北福人药业公司将鞘蕊苏从云南移植湖北通城实施规范化种植。
本论文对鞘蕊苏有效成分芳樟醇合成酶基因进行了调控研究，以期为培养鞘蕊苏优良种质提供科学依据；并对该药用植物花粉的形态结构、生长条件、活力测定等生药学特征进行了较系统研究，为其规范化种植提供了科学实验依据。
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第一章 文献综述
在印度的传统草药疗法中，鞘蕊苏被用于治疗湿疹、牛皮癣、哮喘、高血压和心血管疾病，而这些疾病的发生通常是因为细胞内 cAMP 水平降低引起的[1]。现代药理学研究表明，鞘蕊苏提取物对支气管哮喘、充血性心力衰竭、多种肿瘤具有明显生物活性[2-3],在我国，由于野生毛喉鞘蕊花资源十分稀缺，仅在云南会泽、东川等地有少量发现，因此被中国植物学家界定为珍稀药用植物[4]。由于鞘蕊苏为全草入药，其有效成分为萜类化合物，芳樟醇（3,7-二甲基-1,6-辛二烯-3-醇）为鞘蕊苏单萜类成分，存在于植物精油中，在治疗过程中起着重要作用。
芳樟醇气味芳香，全世界每年对其的使用量超过一千吨，用于化工和医药行业，超过任何一个天然化合物的使用量。在化工方面，芳樟醇被用于香味添加剂添加于化妆品、香水和肥皂、洗发水等洗涤剂[5]；在医药方面，早期芳樟醇被用于治疗急慢性疼痛或白色念珠球菌、大肠杆菌等细菌的抑制剂[6]，近年来，芳樟醇的药理作用得到进一步完善，临床多采用其镇痛抗炎特性用于治疗由糖尿病或心血管疾病引起的炎症疼痛反应[7-8]，值得一提的是芳樟醇的抗肿瘤作用已被许多学者研究证实，基于其安全有效廉价的特点，如果用于临床将会是广大癌症患者的福音。目前芳樟醇的药理作用及机制正在被国内外学者深入研究，现将其药理作用及植物体内合成途径做如下综述：
1 芳樟醇的药理作用研究
1.1 镇痛作用
疼痛作为人体自我保护性的应激反应，分为急性疼痛和慢性疼痛，通常伴随着皮肤、组织或器官损伤，是预示疾病发生的重要征兆和诊断疾病的重要依据，如果没有受到及时重视将会引起难以预知的后果[9]。目前临床常用的镇痛药主要是阿片类镇痛药如吗啡、可待因等和人工合成镇痛药如哌替啶、曲马多等。由于这两类镇痛药在反复使用后会使患者产生成瘾性及难以纠正的戒断症状[10]，所以从中药中寻找具有镇痛作用且无此不良反应的天然活性成分已然成为一项十分热门的研究领域。中药资源丰富、成分复杂，目前对具有镇痛作用的成分研究主要集中在多糖、生物碱、黄酮、挥发油和皂苷等活性成分，而芳樟醇作为挥发油类成分，是研究最多的单萜类化合物[11]。Batista 等[12]在左旋芳樟醇对谷氨酸致小鼠疼痛的影响研究中发现，以外周、全身及脊柱 3 种方式给药即口服（5-100mg/kg)、腹腔注射（10-200mg/kg）和鞘内注射（0.1-3ug/site)左旋芳樟醇可以显著抑制由谷氨酸引起的小鼠疼痛；另外，当给小鼠腹腔注射最大剂量200mg/kg 左旋芳樟醇时，还可以显著缓解由氨甲基磷酸（AMPA）、天冬氨酸（NMDA）和红藻氨酸（Kainate）引起的疼痛，其镇痛作用机制是通过左旋芳樟醇可以剂量依赖性地与谷氨酸受体(Glutamate、AMPA、NMDA、Kainate)相互作用从而间接抑制谷氨酸诱导的疼痛反应。佛手柑精油（BEO）主要含有芳樟醇和乙酸芳樟酯，Kuwahata[13]等通过对局部坐骨神经结扎（PSNL）所致的神经过敏性疼痛模型小鼠足底注射 BEO 或芳樟醇，发现 BEO 和芳樟醇可以剂量依赖性地减轻 PSNL 所致的神经过敏性疼痛，并且当 BEO 或芳樟醇在无效剂量下与吗啡联合使用时可以提高吗啡的抗机械性疼痛作用，其作用机理是 BEO 和芳樟醇可以显著抑制由 PSNL 诱导的脊髓细胞外蛋白激酶活性，从而起到镇痛作用。
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2 芳樟醇的生物合成途径研究
2.1 萜类化合物的合成
植物体通过不同的萜烯合酶催化不同底物生成萜类化合物。其中单萜由单萜合酶催化香叶基焦磷酸（geranyl diphosphate,GPP）生成，倍半萜由倍半萜合酶催化法尼基焦磷酸（farnesyl diphosphate, FPP)生成，二萜由二萜合酶催化香叶基香叶基焦磷酸（geranyl- geranyldiphosphate,GGPP）生成。萜类化合物在植物体内合成途径有两条，分别是：甲羟戊酸途径（mevalonate pathway，MVA pathway）和 5-磷酸脱氧木酮糖/甲基赤藓糖醇途径（1-deoxy-D- xylulose-5- phosphate/ 2C-methyl-D-erythritol- 4-phosphate pathway，DXP/MEP pathway）[33]。
2.1.1 MVA 途径[34-35]
MVA 途径主要在细胞质中进行，以乙酰辅酶 A（acetyl-coenzymeA,CoA）为起始物，三个 CoA 分子在乙酰辅酶 A 酰基转移酶（acetyl-CoAacetyltransferase,AACT）和 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶 A 合成酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase,HMGS）的催化作用下生成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶 A（HMG-CoA），HMG-CoA 被 HMG-CoA 还原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase，HMGR)还原成甲羟戊酸（mevalonate，MVA），随后 MVA 与甲羟戊酸激酶（mevalonate kinase，MK）作用引入一个磷酸基生成磷酸甲羟戊酸（phosphomevalonate,MVAP），MVAP 又在磷酸甲羟戊酸激酶（phosphomevalonate kinase，MPK）作用下引入一个磷酸基生成焦磷酸甲羟戊酸（pyrophosphomevalonate ,MVAPP），最 后 MVAPP 被 焦 磷 酸 甲 羟 戊 酸 脱 羧 酶 （ pyrophosphomevalonatedecarboxylase，MDC）脱掉羧基生成异戊烯焦磷酸（isopentelylallyldiphosphate，IPP），IPP 在 IPP 异构酶（IPP isomerase）作用下异构化为 DMAPP。
2.1.2 DXP/MEP 途径[34-35]
该途径主要在质体中进行，是以 5-磷酸-脱氧木酮糖合成酶（ 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase ， DXS ） 催 化 丙 酮 酸（pyruvate）和 3-磷酸甘油醛（D-glyceradehyde-3-phosphate，GA-3P）缩合成 DXP 开始，随后 DXP 被 5-磷酸-脱氧木酮糖异构还原酶（DXR）异构化并还原成 MEP，MEP 经过一系列磷酸化及环化生成 IPP 及 DMAPP。MVA 及 MEP 途径均可以生成 IPP 和 DMAPP，只是其合成机制及细胞定位不同，其中倍半萜的前体物 FPP 主要在细胞质中由 MVA 途径合成，而单萜和二萜的前体物 GPP、GGPP 主要在质体中由 MEP 途径合成。现代研究表明，两种途径生成的前体物质可以相互交换，MVA 途径生成的 IPP 可以进入质体生成单萜或二萜，MEP 途径生成的 IPP 可以进入细胞质生成倍半萜，由此表明单萜合成主要在质体中进行，少量单萜在细胞质中合成[36-38]。
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第三章 鞘蕊苏的花粉形态及其活力测定......................... 48
1 仪器与材料............................................. 48
2 实验方法............................................... 48
2.1 花粉形态.......................................... 48
2.2 花粉活力测定...................................... 48
3 实验结果............................................... 49
3.1 花粉形态观测...................................... 49
结语与创新.................................................. 55
第三章 鞘蕊苏的花粉形态及其活力测定
1 仪器与材料
光学显微镜（OLYMPUS）；JSM-6510LV 钨灯丝扫描电子显微镜(日本电子株式会社)；HP1500GS-B 智能人工气候箱( 武汉瑞华仪器设备有限责任公司)。
毛喉鞘蕊花采自云南省会泽县，经湖北中医药大学生药教研室吴和珍教授鉴定为唇形科鞘蕊花属植物毛喉鞘蕊花 Coleus forskohlii (Wild)Briq。
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2 实验方法
2.1 花粉形态
采用扫描电子显微镜观测。将干燥成熟的花粉均匀撒在贴有导电胶带的样品台上，再用离子溅射仪喷镀金膜 5 min，于 JSM-6510LV 钨灯丝扫描电子显微镜下观察并拍照。观察 5 个花粉群体，共随机选取 100 粒花粉测量极轴（P）、赤道轴（E）长度及极轴与赤道轴比值（P/E）。
2.2 花粉活力测定
2.2.1 TTC（2，3，5-氯化三苯基四氮唑）染色法
取少量花粉置于载玻片上，加入 1～2 滴 0.5%TTC 溶液，盖上盖玻片，放 35 ℃恒温箱中温育 20 min，光学显微镜观察。生活力强的花粉被染成深红色，生活力弱的被染成淡红色，不具活力的花粉保持无色。每次观察2 个制片，每个制片 3 个视野，每个视野统计花粉数不少于 50 粒。花粉活力用下式计算：花粉活力=被染红的花粉数量/观察花粉总量×100%
2.2.2 I2-KI 染色法
取少量花粉置于载玻片上，加 1～2 滴 I2-KI 溶液，盖上盖玻片后置于 20 ℃恒温箱 30 min 后于显微镜下观察，具有活力的花粉被染成蓝色。统计方法同 2.2.1。
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结语与创新
针对通城种植鞘蕊苏药材有效成分偏低的科学问题，本论文对鞘蕊苏有效成分芳樟醇合成酶基因进行了调控研究，并对该药材花粉的形态结构、生长条件、活力测定等生药学特征进行较系统研究，其研究结果为鞘蕊苏药材规范化种植提供了科学实验依据。
1.采用分子生物学技术，首次对鞘蕊苏有效成分芳樟醇合成酶基因进行了克隆研究，构建了其表达载体，并成功表达出目的蛋白。其研究结果为后续深入研究奠定了良好基础，并为培育鞘蕊苏优良种质提供了理论依据。
2.采用现代化生药学技术，首次对鞘蕊苏的花粉形态结构、花粉管生长条件、花粉活力测定进行了研究。其研究结果为通城种植鞘蕊苏规范化种植提供科学实验依据。
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参考文献（略）