第一章 秀丽隐杆线虫的帕金森病模型建立
1、前言
早在 20 世纪 70 年代，Brenner. S[4]就致力于秀丽隐杆线虫的研究，发现其可作为新型模式生物替代传统的实验动物模型应用于疾病及药物领域的研究。经研究发现，目前利用秀丽隐杆线虫建立的帕金森病模型主要为药物诱导模型和转基因模型两种方式。药物诱导模型是通过神经毒素染毒获得，如重金属 Mn、Hg，百草枯（paraquat, PQ），MPTP(1-甲基-4-苯基-四氢吡啶)，MPP+（1-甲基-4-苯基吡啶盐离子，1-methyl-4-phenylpyridine，其为 MPTP 的活性代谢产物且毒性作用强于MPTP）和 6-羟基多巴胺均可通过选择性诱导多巴胺能神经元凋亡，导致秀丽隐杆线虫的运动能力下降、死亡数增加。综合考虑材料来源和实验重复性的问题，实验组选用 MPP+药物诱导方式造模。
野生型秀丽隐杆线虫（C. elegans）株系 N2，其在 20℃培养温度下可发生自体繁殖，这种自我繁殖的能力有利于得到具有同一基因型的纯合体，一生产卵可达 300 个[5,6]，生长周期短为 3d 左右，经历幼虫期（L1、L2、L3、L4）和成虫期，生命周期长约 20d 左右，逆环境条件下（如高温、拥挤或饥饿）可进入 dauer 期（抵抗逆环境的状态）。成虫长度约 1~2mm，通体透明，其能像细菌一样在-80℃冰箱中长期保存[7]，它有味觉和嗅觉，并能感受光、接触、温度、化学物质、离子等刺激。线虫的神经信号传导系统具有高度的保守性，且其中存在超过 42%的人类疾病相关基因[8]。(秀丽隐杆线虫以下简称线虫或 C. elegans)
线虫有 959 个体细胞，其中包括 302 个神经元，56 个胶质细胞。根据其形态差异，可将 302 个神经元分为 118 种类型；根据其功能差异，又可将其分为感觉神经元、中间神经元、运动神经元。线虫包含多种与人类相关的神经递质如乙酰胆碱、多巴胺、5-经色胺、谷氨酸、γ-氨基丁酸和神经肽等，且其在神经元中的合成、储存和代谢等过程与哺乳动物也具有高度相似性[9,10]。线虫所具有的大多数离子通道基因与哺乳动物也具有同源性。
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2 实验材料
2.1 实验仪器
Milli–Q 一体式超纯水系统（德国默克密理博）；单人超净工作台（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；BSP-150 生化培养箱培养箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；Motic K-400C 体式显微镜（麦克奥迪实业集团合肥分公司）；YXQ-LS-18SI 自动手提式灭菌锅（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；accujet-pro(普兰德)电动移液器（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；离心机 Centrifuge5702 eppendorf (德国)；其林贝尔 TS-8 脱色摇床转移摇床（江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司）；M165FC 体式荧光显微镜（Leica 德国）；DM2500 正置荧光显微镜(Leica 德国)；AL104 万分之一天平(Mettler Toledo 上海)；PL402-L 电子太平(Mettler Toledo 上海)。
2.2 实验药物与试剂
MPP+（1-甲基-4-苯基-吡啶盐离子），Tryptone Powder（蛋白胨）、Yeast Extract（酵母粉）、Agar（琼脂）、Sodium chloride（氯化钠）、Streptomycin Sulfate（硫酸链霉素）、Ampicillin N（a氨苄青霉素钠）、制霉菌素、胆固醇，MgSO4, CaCl2, K2HPO4,KH2PO4, NaClO，NaOH，DMSO(二甲基亚砜)均购于国药集团化学试剂有限公司；蒸馏水等用水为实验室自制，大肠杆菌（Escherichia coli OP50 株，由中国科技大学生命科学院光寿红教授实验室赠送。阿扑吗啡(Apomorphine)，马来酸麦角乙脲(Lisuride maleate)，左旋多巴（Levodopa）均购于美国西格玛(Sigma)公司。
2.3 实验动物
野生型秀丽隐杆线虫（N2，以下文中出现的野生型秀丽隐杆线虫均以 N2 代替）由中国科技大学生命科学院光寿红教授实验室赠送；
突变型秀丽隐杆线虫: OH1098（ttx-3::rfp; ttx-3 在 AIY 中间神经元特异表达），CX3553 (str-1::gfp; str-1 在 AWB 化学感觉神经元特异表达)，OH7547（cat-2::gfp;cat-2 在多巴胺能神经元特异表达），GR1366 (tph-1::gfp; tph-1 在其它感觉神经元特异表达)均购于美国线虫中心（CGC, Caenorhabditis Genetics Center）。
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第二章 醉鱼草果实中抗帕金森病成分的追踪筛选
1 前言
醉鱼草果实为其果实，其本身有着功效多样性、成分复杂性的特点，但由于采收期的不同，加之缺乏系统性的研究，长期以来都未得到较好的开发和利用，既造成一定的环境污染，又是一种资源的浪费。本课题组长期以来从事醉鱼草果实的研究并从醉鱼草果实中分离出若干化合物，汪洋奎等[4]从醉鱼草的果实中分得木栓醇等 9 个三萜类化合物，均为齐墩果烷型的三萜类化合物，并证实其对 PC12神经细胞具有很好的保护作用。吴德玲等[5]从醉鱼草果实中分离得到两个新的齐墩果烷型三萜苷，分别命名为密蒙花苷 H、密蒙花苷 I。B.H. Tai 等[6]采用色谱分离及波谱鉴定技术从密蒙花中分离得到 6 个齐墩果烷型三萜苷类化合物。任亚硕等[7]通过对醉鱼草果实的研究，从中分离出 22 个化合物，其中有 3 个新化合物，并通过 desrhamnoverbasco saponin、mimengoside I、clinoposaponin III 三个三萜类化合物建立了醉鱼草果实总三萜 HPLC-ELSD 的含量测定方法，同时通过 PC12 细胞实验，证实了其中的三萜类成分具有神经保护作用。这些化合物的发现对醉鱼草属三萜类化学成分的研究均具有一定的推动作用，同时，抗帕金森活性物质的发现及机制研究一直是医药学界研究的热点。课题组长期以来的研究不仅为抗 PD 治疗药物研究提供新来源，也降低了环境的污染，减少了资源的浪费。本章通过新型模式生物——秀丽隐杆线虫建立的帕金森病模型[8~12]，对醉鱼草果实中的抗帕金森病活性成分进行追踪筛选。
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2 实验材料
2.1 实验仪器
AB135-S 十万分之一分析天平（瑞士 METTLER TOLEDO）；EYELA SB-1100旋转蒸发仪（东京理化器械株式会社）， SHB-III 循环式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；FZ-02 型高速中药粉碎机；MiLLi-Q 一体式超纯水系统（德国默克密理博）；ZF-2 型三用紫外仪（上海安亭电子仪器厂）；DZF-6050 型真空干燥箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）。
2.2 实验材料与试剂
柱色谱用硅胶（100-200 目，200-300 目）；薄层色谱用硅胶 G、GF254 均为青岛海洋化工厂生产；大孔树脂 AB-8 型（天津光复精细化工有限公司）；聚酰胺；MCI (CHP 20P，75-150 μm;日本三菱公司生产) RP-18 为 50μm，Merck 公司生产；乙醇为食用酒精；水为自制蒸馏水；分析甲醇；其它试剂均为市售分析纯。显色剂为香草醛-硫酸-乙醇溶液（喷后 105℃加热显色）；2% AlCl3-乙醇溶液；碘蒸气显色。
2.3 药材及线虫来源
采用传统的化学方法，将已制成粗粉的醉鱼草果实用 95%乙醇进行渗漉提取，回收乙醇后浓缩至无醇味，经水分散后，依次用石油醚、乙酸乙酯、水萃取，得到各个萃取部位：石油醚萃取部位 55g（A 部分），乙酸乙酯萃取部位 198g（B 部分），水部位浸膏 300g（C 部分）。本课题组前期已从醉鱼草果实的石油醚及乙酸乙酯萃取部位中共分离得到 13 个化合物，并证实其中存在对 PC12 神经细胞具有一定保护作用的化合物，本部分主要通过对醉鱼草果实的乙酸乙酯部位和水提取部位进行活性筛选，并对其进行活性追踪，最终得到活性化合物[13~15]。
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第三章 醉鱼草果实中抗帕金森病活性成分分析..........................34
1、前言 ..............................................................34
2、实验材料 .............................................................. 34
2.1 实验仪器 ............................................................ 34
第四章 全文小结与讨论 ....................................................59
1 秀丽隐杆线虫的帕金森病模型建立部分..................................... 59
2 醉鱼草果实中活性成分的提取及抗帕金森病活性成分的追踪筛选部分 ........59
第三章 醉鱼草果实中抗帕金森病活性成分分析
1、前言
随着对中药和天然药物研究的深入，研究者们已逐步将新药研发的目光转向天然药物的开发利用。但天然产物的结构较为复杂，大多数为非刚性结构，其代谢途径多，代谢产物的种类广泛；在生物样品中其代谢物浓度较低，且内源性杂质较多，这对分析技术提出了很高的要求。Q-tof-MS 是一种高分辨的电喷雾四级杆飞行时间质谱，其显著特点是能够测得化合物的精确分子质量而不降低灵敏度，并通过精确分子质量获得化合物的分子式[1,2]。该项技术被称为天然产物研究强有力的工具，不仅具有质量范围宽，扫描速度快，全扫描模式下灵敏度高等优点，还可提供母离子和大量的多级碎片离子及其精确分子量和元素组成，以供结构鉴定, 从而能够实现复杂基质化合物的测定和鉴定, 在天然产物复杂代谢物的鉴定中具有广阔的应用前景[3]。
本实验在实验前期已从醉鱼草中提取出显示抗帕金森病活性的八个流分，但是八个流分中发挥活性作用的具体成分尚不可知。为了快速、初步的了解活性化合物的具体成分，本实验首次采用高质量精度-多级质谱功能的电喷雾四级杆飞行时间质谱(Q-tof-MS)[4,5]，对已筛选出的醉鱼草果实中具有抗帕金森病活性的八个流分中的化学成分进行指认，并对其进行初步分析，为醉鱼草果实进一步的开发利用提供更多的理论依据[6~8]。
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第四章 全文小结与讨论
1 秀丽隐杆线虫的帕金森病模型建立部分
本实验到目前为止已通过药物诱导损伤的方法，以新型模式生物——秀丽隐杆线虫作为实验动物模型成功建立了与人类相关的帕金森病模型，并从分子生物学的角度加以佐证。秀丽隐杆线虫的 PD 模型的建立，从道德伦理的角度，大大降低了传统实验动物的消耗；从经济上来说，减少了很多费用；从时间的方面，明显的缩减了实验周期。因此，可以说本实验对课题组后期的研究方向具有一定的指导意义。
目前来说，药物诱导损伤方法下建立起来的模型只能用于天然活性产物的初步筛选工作，还不能完全用于支撑作用机制的研究。课题组后期还需对转基因方面的知识加以研究，以期为天然活性产物作用机制方面以及更深入的研究提供强有力的知识储备。
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2 醉鱼草果实中活性成分的提取及抗帕金森病活性成分的追踪筛选部分
本实验通过对醉鱼草果实中抗帕金森病活性成分的追踪，从而进行有目的的提取分离。先使用了大孔树脂和硅胶进行粗分，考虑到醉鱼草果实中化学成分种类繁多但含量较少的因素，为了减少提取分离过程中样品的损失及消耗，实验组相继使用了聚酰胺和 MCI 作为细分的材料。实验最终得到经 MCI 处理后的 8 个流分分别显示出不同程度的抗帕金森病作用。本实验采用的这种根据活性筛选的结果来进行提取分离的定向研究方法，不仅节约了时间，还使得整个实验更具系统性、目的性更强。
实验过程中使用的聚酰胺和 MCI 都是小分子填料，因其吸附能力强，纯化能力高等优势，常被用于天然产物的细分处理阶段。众所周知，聚酰胺分子中含有非常丰富的酰胺基基团，可与多酚类化合物中的酚羟基形成氢键结合而被吸附，且其吸附力随着化合物分子中酚羟基数目越多而增强。聚酰胺的吸附作用主要依附于“氢键吸附”理论，即其通过分子中众多的酰胺羰基与酚类、黄酮类化合物的酚羟基、酰胺键上的游离胺基与醌类、脂肪羧酸上的羰基相互之间形成氢键缔合而产生吸附作用。同时，MCI 因兼具凝胶和大孔树脂的优点，通常被称为是微孔吸附树脂，并可发挥反相硅胶作用。由于 MCI 价格昂贵，因此实验过程中常用于样品的最后处理环节。
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参考文献（略）