前言
清热解肌颗粒系根据著名经方“柴葛解肌汤”, 按照《药品注册管理办法》中药新药的要求研制而成。该方收载于明代陶华所著《伤寒六书》杀车槌法卷之三篇“外感风寒郁而化热，太阳表邪未解郁而化热入里”[1]。由北柴胡[2~3]、干葛[4~6]、羌活[7]、白芷[8~9]、黄芩[10~12]、甘草[13~15]、芍药[16]、桔梗[17~18]等十一味药物组成，主治感冒导致的畏寒身体轻浮，发热，头疼，目疼鼻干，失眠，眼周疼痛等症状[18]。处方药物中北柴胡、羌活、白芷、生姜四味药材均含有挥发油成分，经查阅相关文献[19~23]，文献报道，四味药材种所含有的挥发油成分，具有解热、镇痛、抗炎、抗菌等药效。
原方为汤剂用于临床多年，为了适应现代快节奏生活，我们结合现代化工艺将其制成中药颗粒。因处方中白芷、羌活、生姜、北柴胡四味药材均含有具有药效作用的挥发油成分，且挥发油具有挥发性，因此我们选用β-环糊精对其进行包合，增加挥发油的稳定性。实验中选用单因素试验，优选药材挥发油最佳提取工艺条件以及正交试验设计筛选得到最佳包合工艺条件。并选用 GC-MS 对挥发油成分进行分离鉴别，确定指标性成分，进而用 GC 法测定清热解肌颗粒中挥发油含量，一并测试了药材挥发油含量以及挥发油包合物中挥发油含量，为后期清热解肌颗粒挥发油质量标准的制定提供了一定的依据。
1 药材挥发油药理作用研究概况
清热解肌颗粒由北柴胡、葛根等药材组成，其中含有挥发油成分的药材有北柴胡、羌活、白芷、生姜 4 味。北柴胡 归属伞形科植物，系柴胡 Bupleurum chinense DC.或狭叶柴胡Bupleurum scorzonerifolium Wild 的干燥根。性辛、味苦；偏寒，归胆、肺经。多用于治疗感冒发热，寒热往来等。其主要化学成分为柴胡皂苷(Saikosaponin）a、b、c、d，以及挥发油类如有 2-甲基环戊酮(2-Methyl cyclopentaone)，柠檬烯(Limonene)，月桂烯(Myrcene)等。研究表明，柴胡具有镇静、止痛、降温、镇咳、抗炎抗菌、保肝利胆、降血压、抗病毒、抗肿瘤等药理活性。柴胡的中成药制剂品种众多，柴胡皂苷溶于水，大多以煎煮法提取柴胡皂苷类成分，以水蒸气蒸馏法提取挥发油[24]。
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2 药材挥发油成分研究概况
上述 4 味药材中，仅羌活药材在中国药典中有规定，其所含挥发油不得低于1.4%（mL·g-1），其它 3 味药材均没有规定含挥发油的限度[31]。
北柴胡 霍梦逸等[32]报道：柴胡水蒸气蒸馏 6h，出油率约 0.03%。柴胡挥发油成分的 GC/MS 分析结果，主要含有:β－蒎烯、庚醛、十一烷、α-蒎烯、月桂醛等。
羌活 杨仕兵等[33]报道：产地为青海的羌活药材挥发油的经过 GC/MS 分析,结果主要成分为：α－蒎烯、D-柠檬烯、β－蒎烯、亚油酸、β-水芹烯、单环萜烯酮、芹菜脑等。李树珍等[34]报道：羌活主要成分：α－蒎烯、β－蒎烯。
白芷 杨祖金等[35]分析白芷挥发油提取物的化学成分，结果其中主要化学成分有：α－蒎烯、r -萜品烯、β－蒎烯、榄香烯、β－水芹烯、、十三醇等。张强等[36]报道：经气相色谱一质谱联用分析，杭白芷中挥发油提取物的主要成分：α－蒎烯、壬基环丙烷、β－水芹烯、β－倍半水芹烯、反式石竹烯等。
生姜 李翔等[37]报道：利用气相色谱-质谱(GC-MS)法进行干姜挥发油化学成分的分析结果为，含挥发油组分有： α－蒎烯、檬烯、β-水芹烯、柠龙脑、1，2-丙二醇、β-姜烯、金合欢稀等。热增才旦等[38]报道：运用气质联用色谱技术分析干姜中的挥发油成分，主要成分为: β-蒎烯,樟烯, 龙脑、1-甲基-4-[1-甲乙烯]环己烯、雪杉-8-烯等。邱琴等[39]报道：在水蒸气蒸馏法提取干姜片挥发油中,姜烯占据主要位置,相对含量 9.12% ,其次为β-倍半水芹烯,所占含量比例为7.99 %、β-水芹烯,占含量比例的 7.71%。除此之外，含量较高的还有莰烯(7.32 % )、ɑ- 法尼烯(6.35%)、β-红没药烯(5.14%)、姜黄烯(4.95%)、ɑ-蒎烯(4.10%)、β-柠檬醛(3.13%)等。
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第一部分 清热解肌颗粒制备工艺研究
第一节清热解肌颗粒挥发油的提取工艺研究
清热解肌颗粒系根据著名经方“柴葛解肌汤”研制而成。“柴葛解肌汤”处方收载于明代陶华所著《伤寒六书》杀车槌法卷之三篇。处方中包含有羌活、生姜、白芷、羌胡、葛根、甘草、黄芩等十一味药材，具有清热解肌作用，主要治疗由感冒（风寒郁而化热证）引发的畏寒、失眠、头疼、鼻子干涩等症状。清热解肌颗粒中的羌活、白芷、生姜、北柴胡四味药材中均含有挥发油成分，查阅相关文献报道，挥发油为上述 4 味药材的主要有效成分，其药效与本制剂的解热、镇痛、抗炎、抗菌等药效基本相符。
1 处方组成
北柴胡、白芷、生姜、羌活等共十一味药材。
2 处方药物性质分析
本处方中北柴胡、羌活、白芷、生姜四味药材均含有对治疗有效的挥发油成分，为了控制制剂中挥发油含量符合标准，在制剂前需要对上述四味药材，先提取上述四味药材中挥发油再与其他药材共同制粒。
功效有退热、化郁、补气等，多治疗感冒引起的发热。其主要化学成分为柴胡皂苷(Saikosaponin ）a、b、c、d，以及挥发油类如有 2-甲基环戊酮(2-Methylcyclopentaone)，柠檬烯(Limonene)，月桂烯(Myrcene)等。研究表明，柴胡药理活性有抗病毒、镇静、抗炎、降温、止痛、镇咳、抗菌、保肝利胆、抗肿瘤等[6]。柴胡的中成药制剂品种众多，柴胡皂苷溶于水，大多以煎煮法提取柴胡皂苷类成分，以水蒸气蒸馏连续回流提取柴胡药材中挥发油[24]。
清热解肌颗粒中所含羌活、白芷、生姜、北柴胡四味药材中均含有挥发油成分，查阅相关文献报道[19~21，23]可知，四味药材中所含的挥发油成分为有效的药效成分，因此，需要将其中所含的挥发油先提取出来，再与其他药材一同制备。北柴胡、羌活、白芷和生姜 4 味药材均收载于《中国药典》2010 年版一部中，其中，羌活药材含挥发油药典规定不得低于 1.4%（mL·g-1），其它 3 味药材药典中均没有规定含挥发油的限度[31]。因此，我们参照药典挥发油提取方法，采用水蒸汽蒸馏法对四味药材中挥发油提取量做初步考察。
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第二节 清热解肌颗粒中挥发油-β环糊精包合物包合工艺研究
1 仪器与试药
1.1 仪器
AR1140 型电子天平（深圳市凯铭杰仪器设备有限公司）；DF-101S 集热式恒温加热磁力搅拌器（陕西太康生物科技有限公司）；FD-2 冷冻干燥机（上海比朗仪器有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）。
1.2 试药
三批中间体-挥发油（批号分别为 20150128-1、20150129-1、20150130-1）由四味药材（生姜、白芷、北柴胡、羌活）按照处方比例经过水蒸气蒸馏提取所得，在沈阳红药安徽制药有限责任公司颗粒剂 GMP 车间生产，β-环糊精购自淄博千汇生物科技有限公司，无水乙醇、石油醚选用分析纯，水为实验室自制纯化水。
2.包合方法选择
运用β-环糊精包合技术对药物进行包合后，不仅在生物利用对方有所提升，还在一定程度增加了药物的稳定性。现已被广泛应用于医药行业、 保健品行业以及美容行业等。β-环糊精包合技术与新技术、新设备以及新工艺的完美结合，极大地提高中药挥发油产品的科技水平，促进中药的制剂现代化发展[25]。
查阅相关文献并结合实验室条件，本次试验研究选择溶液磁力搅拌法。查阅相关文献报道，β-环糊精包合效果的好坏影响因素有环糊精投入量、搅拌时间以及包合温度。本实验通过采用正交试验，考察上述各条件变化的实验结果。实验安排见表 18。
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第二部分 清热解肌颗粒质量标准研究................................31
第一节 文献报道中单味药材的挥发油主要成分........................31
1.试药..............................................................31
2.仪器..............................................................31
第三部分 清热解肌颗粒的稳定性考察...................................76
1.试药...............................................................76
2.仪器与色谱条件....................................................... 76
2.1 仪器.................................................................76
第三部分 清热解肌颗粒的稳定性考察
清热解肌颗粒中含有的挥发油成分在储存过程中，随着时间的推移，由于挥发油的挥发性，在储存过程中会造成有效成分的流失，为了考察制剂在不同环境因素影响下其有效成分的含量改变，找出影响挥发油含量稳定性的因素，我们对清热解肌颗粒进行稳定性考察。
1.试药
三批大生产样品（批号：20150128、20150129、20150130）、α-蒎烯（批号：110897-200502，约 0.1mL，供含量测定用）、β-蒎烯（批号：110827-201202，约 0.1mL，供鉴别用）、桉油精（批号：110788-201105，共含量测定用，约 0.1mL，99.9%）均购自中国食品药品检定研究院、乙酸乙酯为分析纯、水为实验室自制纯化水。
2.仪器与色谱条件
2.1 仪器
见第二部分第二节“2.1”项下
2.2 色谱条件
见第二部分第二节“5.3”项下
3.方法与结果
3.1 长期留样试验
按照上市包装，将三批大生产样品（批号：20150128、20150129、20150130）的制剂，在室温（25±2℃）相对湿度（60%±5%）条件下储存 3 个月，取样进行主要成分的含量测定，并将结果与 0 月比较。
3.2 加速试验
清热解肌颗粒按照上市包装，在温度（40±2℃）相对湿度（75%±5%）条件下放置 3 个月，在实验期间第 1 个月、第 2 个月、第 3 个月取样，并对其中的主要成分含量测定，结果与 0 月比较。
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总结
本研究在总结国内外挥发油现代研究文献以及前期挥发油制备工艺研究报道的基础上，对挥发油的提取工艺优选以及挥发油质量标准制定进行系统、全面的研究，在清热解肌颗粒中挥发油质量研究基础上，一并研究考察了挥发油提取物以及挥发油β-环糊精包合物中挥发油含量测定方法，建立了从中间体到成品的挥发油含量测定方法，为后期清热解肌颗粒质量标准的制定提供了一定的参考依据。
首次运用 GC-MS 对清热解肌颗粒中所含的挥发油成分进行分离鉴定，结果共检出 13 个色谱峰，鉴定出 12 个化合物，分别为α-蒎烯、4-萜品烯、桉油精、樟烯、β-水芹烯、萜品烯、肉豆蔻醚、芹菜脑、龙脑、A-姜黄烯、姜烯、B-倍半水芹烯。挥发油提取物中β-蒎烯的含量较少，因此未在化学成分分析表中给出分析结果，但在挥发油含量测定试验中，通过对照品确定其保留时间。由于只获得α-蒎烯、β-蒎烯、桉油精三种对照品，其余成分法定对照品难以购到，因此我们选择α-蒎烯、β-蒎烯、桉油精这三种成分作为含量测定的指标性成分，其余成分（即肉豆蔻醚、β-水芹烯、萜品烯、樟烯、芹菜脑）均以α-蒎烯作为对照计算含量。
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参考文献（略）