第1章综述
1.1微透析技术
上世纪70年代初，西班牙Delgado及瑞典Urban Ungerstedt教授等人首次提出了 “微透析”的概念。微透析(Microdialysis)是一种从生物活体内进行动态微量生化取样的新技术，它将灌流取样技术和透析技术相结合并逐渐发展完善，可用于麻醉或清醒的生物上，用来监测体内和体外的生物事件。其具有活体连续取样、动态观察、定量分析、采样量小、组织损伤轻等特点，特别适合于深部组织和重要器官的活体生化研究，由于它可提供递质释放、摄取和代谢的有关信息，现已成为神经生理学和神经化学的重要研究手段之一。微透析的主要原理为将一种具有透析作用的微细探针置于釆样的生物组织内，通过对插入生物体内中的微透析探针在非平衡条件下进行灌流，物质沿浓度梯度逆向扩散，使被分析物质穿过膜扩散进入透析管内，并被透析管内连续流动的灌流液不断带出，从而达到活体组织取样的目的，再将透析液做进一步的分析检测。通过测定透析液中待测物组分的浓度来研究组织中待测物的水平。这是一种动态连续的取样方法，简单地说，微透析技术的原理就相当于在组织中创造了一个“毛细血管”，使检测对象在浓度差的作用下扩散而进入此“毛细血管”，然后随液体流动带出体外进行检测。微透析技术作为一种采样技术，当它被耦合到分析系统时，可以在细胞外空间或其他水环境中实时反映被分析物浓度随时间变化的有关信息。总之微透析技术能够快速、高选择性、高灵敏地对样品进行在线系统分析，同时也可以获取一些动力学方面的信息。
微透析技术最大的优点是可在基本上不干扰体内正常生理过程的情况下进行在体、实时和在线取样，透析过程探针周围的组织液成分不会发生改变，所以可以持续收集样品。通过微透析技术还可以单独取得细胞外液，具有重要的生物学意义。在对大脑神经递质的释放进行活体动态监测，由于透析液中不含蛋白质和酶等生物大分子，能直接进样进行高效液相色谱和毛细管电泳等生化分析，免除了复杂的进样样品前处理及由此而产生的样品的损失和误差，也不会因在室温取样而发生酶解，大大提高了样品的稳定性，而且随着现代技术的进步可以对微透析试验进行全程的自动化的控制。由于物质跨膜扩散是双向性的，除了可用于监测体内环境的组分生化改变外，微透析技术还可作为一种给药途径，可将药物缓慢而直接地作用于靶器官，改进药效分析和药物代谢动力学研究的水平，特别是局部直接给药更能突出显示这种方法的优越性。还有由于避开了血脑屏障和胎盘的阻隔，可直接观察药物对脑及胚胎的影响。微透析技术的另一大优点是样品的采集与分析过程既可在位又可离位进行。它与HPLC及CE等微量及超微量分离分析技术相结合，具有非常高的选择性和高度的检测灵敏度，几乎适用于所有小分子活性物质的分析，这是其他微环境化学在位检测方法所无法比拟的。
微透析技术的缺点就是对取出的样品进行准确可靠的校正，主要涉及到对探针的回收率的准确测定。探针回收率是指从灌流液中流出的待测组分与标准浓度之比的百分数。探针回收率是影响微透析结果的重要因素，它主要取决于取样部位的生物学性质、透析膜的物理性质(材料、长度、孔径及形状等)、待测物质分子量大小、灌流速度、压力、生物体本身的健康状况和生物组织节律等。目前测定回收率的方法主要有以下几种：（1)外标法：计算被测物质相对浓度的变化时，可简单地采用体外回收率法。测定宜在取样后立即进行，将探针放入已知浓度的标准溶液中，用与体内实验相同的流速灌流探针。达到稳定状态后收集灌流液并立即进行检测，测定浓度与标准溶液浓度之比就是体外回收率。此法虽简单方便，但由于被测物质在体外时与体内的所处的环境状况不同，检测结果不能严格地等同于实际的回收率；（2)内标法：往灌流液中加入已知浓度且性质与被分析物质相似的另一种物质做内标，内标物应该不仅在扩散性质上与被分析物一致，而且还应在体内代谢过程中也尽可能一致，测出透析率即可作为被分析物的回收率。由于内标物选择的局限性很大，限制了此法的应用；（3)反透析法：假设被测组分从两个方向通过半透膜是同等的，在灌流液中加入一定浓度的内标物，在与体内透析完全相同的条件下进行操作，测定透析液中内标物的浓度。本法要求内标物具有一定的生物惰性，尽可能与被测组分相似；（4)低流速法：将灌流速度尽可能降低，一般控制在50 nL/min以下，使回收率接近100%，此时便无需再进行回收率的校正。该方法取样体积极少(一般在5 pL以下)，不但对仪器的检测灵敏度要求极高，而且取样时间长所造成样品的挥发氧化容易影响测定结果的准确度及重现性。
1.2联吡啶钌电化学发光
化学发光(Chemiluminescence，CL)是化学反应的反应物或生成物吸收了反应释放的化学能后所产生的光辐射，是由化学反应引起的发光现象。大多数化学发光是由氧化还原反应引起的，常存在反应试剂不够稳定、在实现时间和空间上难以有效控制、化学发光试剂难以重复利用和溶液混合不均匀所导致的重现性相对较差等问题。电化学发光（Electrochemiluminescence or Electrogeneratedchemiluminescence, ECL)是通过电化学激发反应产生发光的现象，是化学发光方法与电化学方法相互结合的产物。电化学发光分析法除了具有化学发光分析法所具有的仪器简单灵敏度高和线性范围宽等优点外，还具有电化学方法的诸多优点：(1)采用电化学方法可以很容易改变物质的氧化还原能力，可选择更加稳定的试剂、便于电化学可逆的物质的循环利用和便于实现需要极端不稳定的试剂参与的化学发光分析；（2)由于发光是通过电化学方法激发的，特别便于调节发光的时间和空间；（3)可以同时提供电流信号，便于研究反应的发光机理等。常见的电化学发光试剂有联吡啶钌、过氧化草酸酯、鲁米诺、光泽精、9，10-二苯基蒽和量子点等。联吡啶钌不仅应用范围最广泛，而且只有它在水溶液中具有很好的电化学可逆性和稳定性，可以被循环利用，特别有利于与各种分离技术联用和通过循环放大提高分析结果的灵敏度。近年来，联吡啶钌ECL分析法得到快速的发展，成为目前研究最为活跃应用范围最广的ECL体系之一。电化学发光的测试方法主要利用电化学三电极体系，通过对工作电极施加合适的电压，使溶液中的电活性物质之间发生电子得失，在电极表面形成激发态并产生光辐射，利用光检测器捕获并经过计算机处理得到电化学发光信号。按照电活性物质激发态产生条件的不同。
第2章研究报告…………29
2.1固定化联吡啶钌电化学发光结合微透析采样…………........29
2.2在线微透析结合电化学发光技术研究盐酸甲…………37
2.3微透析取样电化学发光传感器研究氢氯噻嗪……………45
结论与展望………………………53
参考文献…………………………55
结论与展望
本文成功设计制作了一种新型的简单方便、高灵敏度的电化学发光传感器结合先进的微透析采样技术在线研究药物蛋白相互作用。主要包括环丙沙星与牛血清白蛋白之间的相互作用，盐酸甲氧氯普胺与人血清白蛋白相互作用，氢氯噻嗪与人血清白蛋白相互作用。药物蛋白相互作用主要有不同温度条件下结合常数及结合位点数的确定和相关热力学参数的确定及结合作用力类型的分析研究，结果比较令人满意。实验结果表明，该方法在药效学和药代动力学研究中具有潜在应用价值。该方法不仅拓展了微透析技术及电化学发光的应用领域，而且在研究药物蛋白相互作用的新方法和技术方面做了一些有益的尝试。