1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要试剂
（1）浓缩型鼠抗人单克隆 CD47 ICC 抗体（杭州华安生物技术有限公司，中国）（2）绿色（FITC 标记）荧光二抗（杭州华安生物技术有限公司，中国）（3）磷酸盐缓冲液 PBS（0.01M, PH7.4～7.6，福州迈新公司，中国）（4）重组人 TSP-1 蛋白（近岸蛋白科技有限公司，中国）（5）封闭液：浓缩型正常山羊血清（博士德生物工程有限公司，中国）（6）4%甲醛（四川科伦生物医药有限公司，中国）（7）RPIM-1640 培养基（Hyclone，美国）（8）胎牛血清(FBS)（Hyclone，美国）（9）胰蛋白酶（Biosharp 生物科技有限公司，中国）（10）二甲基亚砜（DMSO）（上海生工，中国）（11）DAPI（杭州华安生物技术有限公司，中国）（12）CCK8 检测试剂盒（Biosharp 生物科技有限公司，中国）（13）ATP 含量检测试剂盒微量法（北京索莱宝科技有限公司，中国）（14）HMGB1 ELISA 试剂盒（上海茁彩生物科技有限公司，中国）（15）FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit with PI（BioLegend，美国）（16）氯仿（四川科伦生物医药有限公司，中国）
1.1.2 主要仪器
（1）光学显微镜 日本 OLYMPUS（2）荧光显微镜 日本 OLYMPUS（3）数码显微照相系统 日本 OLYMPUS（4）低速离心机 中国 LC-4012（5）双功能气浴恒温振荡器 中国 ZD-85（6）医用冷藏冷冻箱 中国海尔（7）二氧化碳培养箱 德国 Thermo（8）恒温水域箱 中国 HH-W420（9）生物安全柜 中国 Heal Force（10）移液枪 德国 Eppendorf（11）液氮罐 中国 YDS-30-125（12）全波长酶标仪 德国 Thermo（13）流式细胞分选分析仪 美国 BD FACSCCalibur（14）全自动雪花制冰机 中国 IMS-100（15）脱色摇床 中国麒麟 TS-1（16）电热鼓风干燥箱 中国 GZX-9023MBE（17）超纯水机 中国优普 UPH-II-10T（18）高速低温离心机 德国 FRESCO 17（19）高速低温离心机 德国 Thermo（20）医用离心机 Mini Centrifuge（21）立式自动压力蒸汽灭菌锅 中国 ZEALWAY
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1.2 方法
1.2.1 细胞复苏、细胞传代及冻存
（1）细胞复苏：实验开始前用 75%酒精擦拭超净台台面，并按摆放好灭菌的离心管、培养瓶、移液枪、枪头盒等物品灭菌 30 min，所需培养液、胎牛血清、RPIM-1640、双抗（青霉素+链霉素）提前平衡温度。配制培养液（含 10%FBS 的 1640+1%双抗）。事先预热水浴箱至 37℃。事先在超净台上准备好 25 cm3 培养瓶、1.5 ml 离心管，可把培养液提前加入培养瓶内。快速从液氮罐中取出冻存的黏液表皮样癌 MC-3 细胞系，放入 37℃水浴箱中快速融化，将其吸入 1.5 ml 离心管内，离心 5 min，1200 r/min，弃去上层液体，用枪头吸 1 ml 完全培养液于离心管内吹打均匀。将吹打均匀的细胞悬液移入 25 cm3 培养瓶内并加入 1 ml 完全培养液，倒置显微镜下观察培养瓶内细胞悬浮饱满，拧好培养瓶瓶盖，轻缓放入 37℃，5%CO2 孵箱内孵育，过夜后观察细胞贴壁状态。
（2）细胞传代:从孵箱中取出融合度达 70~80%的细胞，枪头弃去旧培养液、PBS 冲洗细胞 2-3 次后弃去 PBS。吸 200 μL 胰酶于培养瓶内，使之完全覆盖瓶底细胞，Timer计时 3 min，至于孵箱 30 s 后取出，拍打瓶身，并同时在显微镜下观察细胞消化状态，待细胞变圆游离后快速加入完全培养液终止消化（操作要快速）。之后用枪头吹打培养瓶壁、将细胞悬液吸入离心管后离心 5 min ，1200 r/min 弃去上清，吸入 2ml 培养液吹匀细胞后，分别在两个培养瓶内加入各 1 ml 细胞悬液（1：2 传代），倒置显微镜下观察培养瓶内细胞悬浮饱满，拧好培养瓶瓶盖，轻缓放入 37℃，5%CO2 孵箱内孵育，过夜后观察细胞贴壁状态。
（3）细胞冻存:从孵箱中取出融合度达 70~80%的细胞，枪头弃去旧培养液、PBS 冲洗细胞 2-3 次后弃去 PBS。吸 200 μL 胰酶于培养瓶内，使之完全覆盖瓶底细胞，Timer计时 3 min，至于孵箱 30 s 后取出，拍打瓶身，并同时在显微镜下观察细胞消化状态，待细胞变圆游离后快速加入完全培养液终止消化。之后用枪头吹打培养瓶壁、将细胞悬液吸入离心管后离心 5 min ，1200 r/min。弃去上层培养基，PBS 再次清洗细胞吹打均匀后再次离心 5 min 1200 r/min。细胞冻存液（1：9）（DMSO：FBS）将 900 μLFBS 加入离心管中吹打均匀成细胞悬液后加入冻存管中；将超净台灯关闭，避光操作，加入 100 μL 的 DMSO 于冻存管内，将冻存的细胞放入程序降温盒内置于-80℃冰箱内过夜后放入液氮中存放。
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2 结果
2.1 MC-3 细胞增殖活性的检测结果
2.1.1 不同浓度 TSP-1 作用不同时间对 MC-3 的细胞生长活性结果
（1）以下各图表中均为 TSP-1 实验组抑制率数据：当浓度(0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 及 1.6 μmol/L)一定时，TSP-1 对于 MC-3 抑制作用随着时间(24h、48h、72h) 增加对细胞的抑制作用增强。各药物浓度在 72h 抑制率最大，对细胞的活性抑制作用最强(见表 1、图 1-1、图 1-2)。
（2）通过 one-way ANOVA 统计分析结果如下：①24h：TSP-1 各浓度对 MC-3细胞无明显抑制作用。0.05 μmol/L、0.2 μmol/L 组抑制率与对照组相比无统计学差异。0.1 μmol/L 组抑制率与对照组相比存在统计学差异（P＜0.05）。TSP-1 浓度为 0.05μmol/L、0.4 μmol/L、0.8 μmol/L、1.6 μmol/L 组时其对 MC-3 的抑制率为负数，除 0.05μmol/L 外其余抑制率与对照组相比均存在统计学差异（P＜0.05）。②48h:TSP-1 浓度为 0.05 μmol/L、0.1 μmol/L、0.2 μmol/L、0.4 μmol/L 组时对 MC-3 细胞均有抑制作用，其中 0.05、0.1、0.2 μmol/L 组抑制率与对照组相比有统计学差异（P＜0.05）。但 TSP-1 浓度为 0.8 μmol/L、1.6 μmol/L 组时其对 MC-3 的抑制率为负数，其中浓度为 1.6 μmol/L 抑制率与对照组相比存在统计学差异（P＜0.05）。③72h：TSP-1 浓度为 0.05 μmol/L、0.1 μmol/L、0.2 μmol/L、0.4 μmol/L、0.8 μmol/L 组时对 MC-3 细胞均有抑制作用，均存在统计学差异（P＜0.05）。但 TSP-1 浓度为 1.6 μmol/L 组时其抑制率为负数，与对照组相比无统计学差异。
（3）通过分析数据（见表 1、图 1-1、图 1-2）及结合以上的结果分析，各浓度的 TSP-1 在 72h 时对 MC-3 细胞的抑制作用较强，所以在后续实验中我们采用 72h 的IC50，其浓度为 0.09027 μmol/L（约 0.1 μmol/L）。
表 1 不同浓度 TSP-1 干预 24h、48h、72h 后 MC-3 的细胞生长抑制率（xs，n=3，%）
2.2 TSP-1 与 PTX 单独及联合作用诱导 MC-3 细胞凋亡的结果
2.2.1 TSP-1、PTX、TSP-1+PTX 组作用 72h 诱导 MC-3 细胞凋亡的结果
one-way ANOVA 统计分析流式细胞仪检测结果显示如下图（见图 3、表 3-1、图3-1）：TSP-1 组、PTX 组、TSP-1+PTX 组作用 72h 后均能诱导 MC-3 细胞凋亡，且凋亡率逐渐增高，其中二联用药组细胞凋亡率最高，各药物实验组细胞凋亡率分别与对照组相比，均有统计学差异（PTSP-1=0.0497,PPTX=0.0087,PTSP-1+PTX=0.0042,P＜0.05）。
图 3 TSP-1、PTX、TSP-1+PTX 组作用 72h 后 MC-3 细胞凋亡图
材料与方法………………………………9
结果………………………………16
讨论…………………………………25
结论…………………………………29
3 讨论
3.1 TSP-1、CBP、PTX 单独及联合作用对 MC-3 细胞增殖活性及凋亡的影响
本实验通过 CCK-8 法和流式细胞术检测不同浓度 TSP-1、CBP、PTX 单独及联合作用于 MC-3 不同时间后对 MC-3 细胞的增殖活性及凋亡情况。在本实验中我们查阅文献得知，Anne Saumet 等人表明 TSP-1 作用于耐药急性早幼粒细胞白血病衍生出的 NB4 细胞（NB4-LR1），它与 CD47/αvβ3 相互作用可触发不依赖半胱天冬酶的细胞死亡，其最低作用浓度为 0.1 μmol/L[62]。因为 TSP-1 在 MC-3 细胞系中研究较少，所以据此我们筛选了 6 组 TSP-1 浓度（0.05 μmol/L、0.1 μmol/L、0.2 μmol/L、0.4 μmol/L、0.8 μmol/L、1.6 μmol/L）。本实验研究结果显示同一浓度的 TSP-1 随时间的增加对细胞的抑制作用逐渐增强，经统计分析 TSP-1 浓度为 0.09027 μmol/L 并且作用 72h 对MC-3 细胞的增殖能力抑制效果最强，所以后续实验 TSP-1 浓度采用 0.1 μmol/L 作用时间为 72h。以往多项研究证明 TSP-1 通过以下方式抑制血管生成：（1）抑制上皮细胞迁移；（2）诱导内皮细胞凋亡；（3）抑制生长因子[63]。所以本实验中 TSP-1可能通过某些机制对 MC-3 细胞的增殖产生抑制作用。但实验过程中我们发现 TSP-1对 MC-3 细胞增殖的抑制率有的为负数，经查阅文献得知，Hiroaki Kamijo 等研究人员发现重组 TSP-1 以剂量依赖性方式显著增加皮肤 T 细胞淋巴瘤（CTCL）细胞系的增殖[64]。所以结合文献及本实验结果说明在一定条件下低浓度 TSP-1 对 MC-3 起抑制细胞增殖的作用，而高浓度 TSP-1 对 MC-3 可能起到促进细胞增殖的作用。为了证实TSP-1 能抑制 MC-3 细胞的增殖、诱导其凋亡，并引发与 ICD 相关因子 CD47、ATP、HMGB1 的改变。我们选用了临床上已被证实的对多种肿瘤细胞有增殖抑制、促进癌细胞凋亡及能引发 ICD，并且广泛应用于头颈肿瘤的化疗药物（如 PTX，CBP）作为阳性药物对照组[65-68]。
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4 结论
（1）0.1 μmol/L 的 TSP-1 对 MC-3 细胞具有最佳的增殖抑制作用，并可诱导 MC-3细胞凋亡。
（2）TSP-1 与 PTX 联合用药效果对抑制 MC-3 细胞的增殖能力和诱导其凋亡能力较单独用药组更强。
（3）TSP-1 可诱导 MC-3 细胞 CD47 蛋白表达的下调，并使 CD47 从点簇状变为分散的团雾状。
（4）TSP-1 可诱导 MC-3 细胞释放 ICD 相关因子 ATP 及 HMGB1。
参考文献（略）