通过模拟癌细胞转移的失巢环境，观察 CD24 对失巢凋亡的影响

细胞与基质的相互作用对于正常上皮细胞的存活与生长非常必要。正常上皮细胞一旦离开细胞基质，就会发生凋亡，这种凋亡方式叫失巢凋亡。 失巢凋亡能使正常细胞在增殖、分化与凋亡中保持一个动态平衡，从而能确保细胞和组织内环境的稳态。抵抗失巢凋亡与锚定依赖是恶性肿瘤细胞的一个特点，在肿瘤细胞转移中起重要作用。肿瘤要完成远处转移和侵袭，肿瘤细胞必须得脱离原来的瘤体，进入脉管或者淋巴管，而正常的细胞在脱离了细胞基质，细胞与基质之间调节细胞存活的信号就会中断，细胞就会凋亡。恶性肿瘤的其中很重的一个特点就是肿瘤细胞从原来的位置脱落以后能够种植或者通过脉管或淋巴管转移到其他地方继续生长。在导致病人死亡的原因中约 90%的癌症病人死于转移。肿瘤的转移是一个多步骤的复杂的过程。这其中涉及到肿瘤细胞从原来的瘤体脱落、转移中细胞外基质的退化、细胞迁移、非锚定依赖生长、逃避凋亡、血管再生，侵犯周围的组织，细胞粘附、运动，完成在远处的定植。在抵抗失巢凋亡的过程中，一些逃避失巢凋亡的信号途径被活化。研究发现在抗失巢凋亡过程中死亡受体途径及线粒体途径均被活化。细胞在脱离基质的同时触发线粒体的抗凋亡蛋白 Bcl-xL 表达下调。并且在细胞脱离基质后活化死亡受体的 Fas 配体上调[。近年来发现粘附诱导的失巢凋亡的抵抗或许可以解释肿瘤细胞在立体培养下与标准的单层培养下细胞存活的不同。近些年发现粘附分子 CD24 在肿瘤的浸润转移与侵袭过程中发挥着重要作用。CD24 是一个有 27 个氨基酸的小片段的高度糖基化的粘蛋白，通过甘油磷脂酰肌醇连接在细胞表面[10]。研究表明CD24 的高度糖基化是高度变异并且是细胞类型依赖性的。作为膜蛋白，CD24的糖基化的位点充当细胞连接点上分子间相互作用传递信号的媒介，介导细胞与细胞间，细胞与基质间的黏附，这种黏附与淋巴细胞转移和神经网络形成有关[27,28]。P 选择素是 CD24 的唯一的配体，生理情况下 CD24 介导中性粒细胞和单核细胞的粘附在表达 P 选择素的活化的血小板和内皮细胞表面[29]。一些研究发现 CD24 广泛表达在多种造血系统肿瘤和实体瘤中[30-34]。并且和肿瘤的侵袭转移，复发和预后密切相关。在女性生殖系统,卵巢乳头状腺癌肿瘤细胞的 CD24mRNA 表达明显上调。免疫组织化学显示,正常卵巢细胞不表达 CD24, 交界性肿瘤和上皮性卵巢癌有明显高表达，CD24 的高表达能明显缩短侵袭性卵巢癌病人的的生存期[11]。Yang 等发现 CD24 在高转移肝细胞癌细胞和复发的肝细胞癌组织中明显高表达。抑制 CD24 的表达能够降低细胞的增值，转移和侵袭能力。术后经导管动脉化学栓塞能够降低 CD24 阳性的肝细胞癌患者的复发率。并且发现CD24 和活化的 Wnt/β-catenin 通路也有关系。说明细胞 CD24 的过表达与肿瘤的高侵袭高转移高增殖有关。实验还提示 CD24 高表达是肝细胞癌术后不良预后的一个指标[12]。由于 CD24 参与细胞与细胞，细胞与基质间的粘附，而肿瘤细胞的特点就是癌细胞从固有的瘤体脱落，脱离了细胞与细胞，细胞与基质的粘附后，并不能像正常的细胞一样发生失巢凋亡，那么 CD24 是否在肿瘤细胞抵抗失巢凋亡的过程中起作用呢？其机制又是什么呢？阻止 CD24 的表达又对肿瘤抗失巢凋亡能力又有什么影响？
材料和方法
材料
（一）细胞株：高转移性卵巢癌细胞株 HO-8910PM 购于中国科学院细胞库（上海），卵巢癌细胞株 A2780 购自于中国典型培养物保藏中心(武汉)。
（二）主要试剂：1.RPMI-1640 培养基：美国 Hyclone 公司产品。2.小牛血清：美国 GIBCO 公司产品,分装后保存在-20°。用时按体积比例 10%加入到 RPMI-1640 培养基中。3.PBS:购自于武汉博士德生物科技责任有限公司，每包用双蒸水配置 1000ml，磁力搅拌器搅拌使其充分溶解后分装，高压后 4°保存。4.胰酶粉剂：购自于美国 Amresco 公司，称 0.25g 胰蛋白酶粉剂，加入 100mlPBS溶液中，再加入 0.02g 的 EDTA，配置成浓度为 0.25%的溶液用于细胞消化，充分溶解后过滤除菌，4°保存。5. Trizol 溶液：购自美国 GIBCO 公司6. RT-PCR 试剂盒：购自日本 Toyobo 公司。7.poly-hema（聚甲基丙烯酸羟乙基脂）：美国 Sigma 公司产品（武汉大风科技公司代理）。是一种阴离子聚合物，用其包被培养板能抑制细胞的贴壁，使细胞成悬浮生长。8.琼脂糖：武汉大风科技有限公司9.SYBR GreenⅠ荧光染料（购自美国 Biotium 公司）。10.Annexin V-FITC 试剂盒：购自南京凯基生物科技有限公司。11．CD24 单克隆抗体：购自于美国 eBioscience 公司（武汉古泰生物科技有限公司代理）。12.GAPDH 引物序列：sense：（购自上海英骏 invitrogen 生物技术有限公司）。13.Maker ladder:武汉大风公司代理14.DEPC:RNA酶抑制剂
(三)主要仪器设备1.37°恒温二氧化碳细胞培养箱（3319S/N,Forma Scientific,USA）2.YJ-1450D型医用无菌操作台（苏州净化设备公司）3.恒温水浴箱（DZ-84，上海跃进医疗器械一厂）4.电子称（Mettler Toledo公司）5.台式高速低温离心机（Labofuge 400R, Heraeus）6.倒置相差显微镜（Olympus,Japan）7.光学显微镜（Olympus,Japan）8.全自动PCR仪（T3 Thermocycler, Biometra, USA）9.恒温恒压电泳仪（Biometra,P25）10.凝胶成像系统（01ympus，TH4-200）11.凝胶电泳分析系统（Biospectum AC Imagine System）12.高温烘烤箱（上海精宏实验设备有限公司）13.紫外分光光度仪（DU650，BECKMAN,USA）14.双蒸水系统（Lonenaustauscher SG）15.-80℃低温冰箱（Thermo Forma -86℃ ULT Freezer）16.4℃、-20℃冰箱（西门子冰箱）17.恒温摇床（江苏金坛市荣华仪器制造有限公司）18.微型离心仪（EPPENDOF）19.流式细胞仪（FACScan; Becton Dickinson）
二、试验方法
（一）细胞培养1.培养条件：细胞用含有10%小牛血清的RPMI-1640培养基置于37℃、5％C02恒温培养箱中培养。2.细胞传代：当细胞相互汇合，整个培养瓶底部大部分被细胞覆盖的时候需进行传代。从培养箱取出细胞，在超净台内倒掉瓶内的旧的培养基。 向瓶内加入1ml的胰酶轻轻摇动培养瓶，使胰酶充分接触到所有细胞表面，然后倒掉胰酶，再加入适量含有0.25%EDTA胰酶，把细胞培养瓶放在倒置显微镜下观察，当细胞胞质回缩，细胞间隙增大变宽后，弃去胰酶消化液，加入适量的1640培养基，用吸管吸取瓶内培养液反复轻轻吹打瓶壁细胞，使其成细胞悬液，然后按1：2比例接种的新的培养瓶中，放入恒温培养箱中继续培养。3.细胞的冻存：前一天换过液的处于对数生长期的细胞胰酶消化收集细胞于离心管并计数，离心去除消化液和培养基，加入0.1ml的DMSO和0.9ml的小牛血清，分装到冻存管中并做好标记。冻存液中细胞的最终浓度一般为5×106~1×107/ml。4℃冰箱放置1小时，再放入-20℃放置约半个小时，然后置于-80℃或者液氮中保存。4.细胞的复苏：从-80℃或者液氮中取出的冻存管立即置于37℃的恒温水浴箱中，并不时摇动以使其尽快融化。融化完全后，无菌台内用吸管将冻存管内的液体转移到离心管中，并加入2ml预温的1640培养基，离心机里低速离心，除去上清，加入适当的培养基轻轻吹打后转移到培养瓶中，置于37℃恒温细胞培养箱中培养。
（二）CD24的检测 一些研究表明小细胞肺癌表达CD24[25]，故将非小细胞肺癌作为表达CD24的阳性对照。1.配制细胞悬液：取对数生长期的细胞用含有0.25%EDTA胰酶消化后，离心机里低速离心后，用含10%的小牛血清的1640培养基配制成单细胞悬液。2.细胞计数：（1）清洁计数板：用酒精浸泡计数板及盖玻片，用绸布轻轻拭干。（2）加样：胰蛋白酶消化细胞后制成的单细胞悬液，用吸管轻轻吹打后吸取少许，在计数板盖玻片的一端的边缘加一滴细胞悬液，放平计数板，使细胞悬液充满盖玻片与计数板之间。加样不能过量溢出盖玻片也不宜过少或有气泡。（3）计数：显微镜下观察计数板四角大方格中的细胞数，细胞压中线时，计左不计右，记上不记下[14]。（4）计算：细胞数/ml原液=(4大格细胞总数/4)×1043.接种：调整细胞浓度为3×105/ml接种到六孔板中。置于37℃，5%CO2培养箱中。