第一章 绪论
1.1 常用灭鼠剂的种类及毒性概述
鼠类属于啮齿目（Rodentia）动物，从家庭农场到沙漠高原无处不在，是世界上分布最广泛的哺乳类动物之一。鼠类对农、牧、林业生产危害巨大，据联合国粮农组织（FAO）统计，世界每年因鼠害造成的农作物的损失占总产值的 10%~20%，牧草的经济损失超过 60 亿元，受害面积达 0.40 亿 hm2（洪军 等, 2014）。鼠类还是多种疾病的宿主，可传播鼠疫、流行性出血热等多种疾病，威胁人类的生命安全（MEERBURG et al., 2009; HIMSWORTH et al., 2013）。世界历史上曾发生过三次鼠疫大流行，共计造成一亿多人的死亡（孟庆云, 2003）。因此，如何控制鼠类种群及鼠传疾病的传播是全世界共同的任务。
化学灭鼠剂根据毒性发作的时间可分为急性灭鼠剂和慢性灭鼠剂。急性灭鼠剂作用时间短，试鼠取食毒饵后一般 3 小时之内就能出现中毒症状，而慢性灭鼠剂导致的中毒症状出现时间大于48 小时（刘晓辉, 2018）。急性灭鼠剂主要包括磷化锌、磷化钙、氟乙酰胺等，这类制剂毒性强，食入后能在短时间内引起鼠类的中毒，由于没有特效解毒剂，对人畜安全隐患较大，因此被多个国家所禁用，我国现在也禁用急性灭鼠剂了（孙承业, 2001; 刘晓辉, 2018）。我国目前登记的杀鼠剂种类主要有 14 种，包括抗凝血类灭鼠剂（敌鼠钠盐、氟鼠灵、杀鼠灵、杀鼠谜、溴敌隆、溴鼠灵）、不育剂（雷公藤甲素、α-氯代醇、莪术醇）、神经麻痹毒素（C 型肉毒杀鼠素、C 型肉毒梭菌毒素、D 型肉毒梭菌毒素）以及增效剂（胆钙化醇）和地芬·硫酸钡（中国农药信息网http://www.chinapesticide.org.cn/）。
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1.2 鼠类抗药性的产生与发展现状
第一代抗凝血类灭鼠剂从上世纪 50 年代开始被广泛使用，不到 10 年的时间就出现了抗性鼠。1958 年，在苏格兰首次发现了抗性褐家鼠（Rattus norvegicus）（BOYLE, 1960），而后在丹麦、荷兰、意大利、美国等地都发现了对杀鼠灵抗性的褐家鼠和小家鼠（LUND, 1964; ROW et al., 1965;OPHOF et al., 1969; JACKSON et al., 1972; BROOKS et al., 1973; ALESSANDRONI et al., 1980）。由于很多地区的鼠类对第一代抗凝血类灭鼠剂都产生了抗性，70 年代末开始广泛使用毒性更强的第二代抗凝血类灭鼠剂，然而不久就发现鼠类对溴敌隆、鼠得克等二代抗凝剂也产生抗性（HADLER et al., 1975）。例如，英国的小家鼠种群对溴敌隆的抗性水平高达 43%（ROWE et al.,1981），KOHN 等发现德国褐家鼠对溴敌隆的抗性率为 17.9%（KOHN et al., 2003）。另外，在欧洲之外的澳大利亚、日本、马来西亚、中国等地也发现了抗性鼠（GREAVES et al., 1976;SAUNDERS, 1978; HUANG et al., 2011; WANG et al., 2008）。
我国从 20 世纪 80 年代开始大规模使用抗凝血类灭鼠剂，1985 年成立了全国抗药性监测协作组，对我国主要害鼠抗药性进行了大规模的调查，发现使用抗凝血类灭鼠剂年限低于 6 年的地区未见抗性鼠（董天义, 2001）。董天义等认为当一个大于 20 个个体的种群中，抗性发生率不低于15%，褐家鼠、小家鼠、黄胸鼠的平均摄药剂量分别达到 12mg/kg、338mg/kg、143mg/kg 时为抗性种群（董天义, 2001; 孙毅 等, 2004）。广东省是鼠疫疫源地之一，也是最早开始使用抗凝血类灭鼠剂的地区，目前已经在该地发现了小家鼠、黄胸鼠、褐家鼠、黄毛鼠种群中发现了抗性鼠。
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第二章 干旱区鼠类抗性基因的多态性及选择信号分析
2.1 实验材料
2.1.1 实验样品
在收集的 46 条鼠类 Vkorc1 基因序列中，10 条通过 PCR 扩增获得，24 条从 Genebank 和已发表的文献中下载，12 条通过从未注释的基因组数据中通过本地 BLAST 获得；24 条 Ggcx基因中 16 条从 Genebank 中直接下载，8 条来自未注释的基因组序列；19 条 Nqo1 基因中 14条从 Genebank 中直接下载，5 条来自未注释的基因组序列；43 条 Cytb 基因中仅有黑缘齿鼠来自 PCR 扩增，其余 42 条序列均从 Genebank 的基因库、核苷酸序列库中下载（表 2-1）。
PCR 扩增部分，本研究野外采集了东方田鼠（Microtus fortis）、内蒙古自治区的布氏田鼠（Lasiopodomys brandtii）、黑龙江的大仓鼠（Tscherskia triton）、广东的黑缘齿鼠（Rattussikkimensis）、黄胸鼠（Rattus tanezumi）、广西的黄毛鼠（Rattus losea）、以及采自新疆的小林姬鼠（Apodemus syhaticus）、柽柳沙鼠（Meriones tamariscinus）、红尾沙鼠（Meriones libycus）和子午沙鼠（Meriones meridianus）。取鼠尾组织置于 70%的无水乙醇中-20℃保存。样品的采集和处理遵循中国农业科学院植物保护研究所动物实验伦理委员会章程。
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2.2 实验方法
2.2.1 DNA 的提取
使用天根公司的基因组 DNA 提取试剂盒提取基因组 DNA，具体操作步骤如下：
（1）取少量鼠尾组织，剪碎至 EP 管中，加入 20 μl 蛋白酶 K 和 200 μl GA，振荡混匀，56℃消化过夜。将完全溶解的组织消化液转移至干净的 EP 管中；
（2）在组织消化液中加入 200 μl 的缓冲液 GB，充分混匀，70℃放置 10 min，待溶液变为澄清，短离心 15 s，去除 EP 管上水珠；
（3）加入 200 μl 无水乙醇，充分振荡混匀，短离心 15 s；
（4）将吸附柱放入收集管中，并将上一步获得的溶液与絮状沉淀转移到吸附柱 CB3 中，12000rpm 离心 30 s，倒掉废液；
（5）向吸附柱 CB3 中加入 500 μl 的缓冲液 GD，12000 rpm 离心 30 s，倒掉废液；
（6）向吸附柱 CB3 中加入 600 μl 的漂洗液 PW，12000 rpm 离心 30 s，倒掉废液，重复此步操作一次；
（7）吸附柱 CB3 放入收集管中，12000 rpm 空离心 2 min，倒掉废液；将吸附柱置于室温放置10 min，晾干吸附柱中的漂洗液。
（8）将吸附柱转移到一个干净的 EP 管中，向吸附膜中心悬空滴加 50 μl 的洗脱液 TE，室温放置 3 min，12000 rpm 离心 2 min，将洗脱的 DNA 收集到 EP 管中后置于-20℃保存。
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3.1 实验材料........................... 31
3.1.1 实验样品.......................31
3.1.2 主要试剂...........................31
第四章 结论.............................39
第三章 我国黄胸鼠 Vkorc1 基因多态性及抗药性
3.1 实验材料
3.1.1 实验样品
黄胸鼠种群Vkorc1基因多态性研究中所用185只黄胸鼠样品包括自湖南26只（长沙21只、娄底5只）、湖北37只（天门7只、黄石3只、云梦27只）、福建6只（建瓯6只）、广东25只（广州25只）、四川36只（成都32只、绵阳2只、犍为2只）、西藏22只（拉萨22只）、甘肃2只（天水2只）、广西3只（昭平3只）、贵州4只（凯里）、江苏23只（如皋23只），取鼠尾或肌肉组织置于70%的无水乙醇中-20℃保存。
将本实验获得的黄胸鼠样品的D-loop序列与NCBI中下载的502条黄胸鼠的D-loop序列（MH303711~MH304211）合并，使用MAFFT 7.0（KATOH et al., 2013）和ClusterX 1.8软件（THOMPSON et al., 1997）比对黄胸鼠D-loop序列，使用DNAsp 5.1软件（LIBRADO et al., 2009）分析D-loop序列的核苷酸多态性（Nucleotide persity, π）、单倍型种类和单倍型多态性（Haplotypepersity, Hd）。对获得的D-loop单倍型序列进行系统发育分析，首先使用ModelTest 2.3软件（POSADA et al., 1998）选择最 佳的碱基替换 模型（HKY+I+G ），使 用Mr Bayes 3.2软件（HUELSENBECK et al., 2001）构建贝叶斯方法的进化树，运行10,000,000代，去掉前20%，用剩余的80%构建一致树。使用Network 10.0（Bandelt et al., 2019）软件基于Median-joining法构建D-loop单倍型网络结构图，使用Arcgis 10.0绘制单倍型组在我国的分布位置。
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第四章 结论
鼠类获得抗性主要通过两种方式，一种是先天获得的抗性，另一种是后天获得可遗传的抗性。抗凝血类灭鼠剂通过阻碍鼠类的维生素K循环，破坏凝血机制来起到灭鼠作用。Vkorc1基因是抗凝血类灭鼠剂作用的靶基因，对该基因及维生素K循环相关基因的多态性的研究有助于了解鼠类抗性产生的原因。
本研究通过对不同鼠种间的Vkorc1、Ggcx、Nqo1基因的多态性进行研究，探究这些基因在干旱地区天然抗性的鼠类中是否发生适应性进化，并讨论导致这种适应性进化的原因。发现干旱环境的鼠类，尤其是地中海小家鼠和嗜沙肥鼠的Vkorc1基因的进化速率高于其它鼠，并且检测到嗜沙肥鼠的Vkorc1基因72位密码子受到正选择，这可能是适应干旱条件下缺乏维生素K环境的结果，但是对于该位点对抗凝血类灭鼠剂的作用还有待进一步研究。进一步研究了我国黄胸鼠种群内Vkorc1基因的多态性，获得3个突变Ala26Thr、Ala41Ala、Tyr139Cys，其中Tyr139Cys突变的频率可以用来评估我国黄胸鼠种群的抗性水平。通过利用线粒体D-loop序列分析不同地理种群之间的遗传结构，发现西藏地区携带Tyr139Cys抗性突变的黄胸鼠可能是从四川西部输入。我国部分黄胸鼠种群已产生明显抗性，因此建议在抗性严重地区应当停止使用低毒的第一代抗凝血类灭鼠剂和溴敌隆，防止抗性水平的继续升高。本研究通过对不同鼠种间和同一鼠种内的抗性相关基因的多态性的分析，探讨了鼠类天然抗性形成的可能因素及导致鼠类抗性的突变，一方面为鼠类抗性遗传机制的研究提供基础，另一方面为鼠害的防治提供用药指导。
下一步需要深入分析黄胸鼠的Vkorc1基因上发现的Ala26Thr突变，从细胞学水平研究该突变是否会对黄胸鼠抗性产生影响；目前Tyr139Cys突变已在黄胸鼠种群中扩散，今后需扩大采样范围，评估不同地区黄胸鼠种群的抗性水平，为合理使用抗凝血灭鼠剂提供指导。
参考文献（略）