第一章 前言
1.1 棉蚜概述
1.1.1 棉蚜的危害
棉蚜（Aphis gossypii Glover）又名瓜蚜，隶属半翅目（Hemiptera）蚜科（Aphididae），是一种世界性的棉花害虫。棉蚜寄主植物广泛，除棉花外，还包括马铃薯、大豆、黄瓜等多种寄主植物。我国各大棉花产地均有棉蚜的分布，主要分布于新疆地区，近年来棉蚜已经从棉花的次要害虫上升为主要害虫（晁文娣等，2019；潘洪生等，2018）。棉蚜主要通过取食植物汁液、分泌蜜露、传播病毒等方式影响植物的正常生长，给棉花等经济作物带来巨大的经济损失（Slosser et al.，1989）。
1.1.2 棉蚜的防治
目前棉蚜的理想防治手段是农业防治、生物防治、化学防治、物理防治相结合的综合防治手段。农业防治手段有：加强田间管理、培育抗虫品种等。生物防治主要通过天敌昆虫，如瓢虫、食蚜蝇、草蛉等来起到控制棉蚜数量的目的。但是我国现阶段防治棉蚜仍主要依靠化学防治，反复使用过高浓度的单一杀虫剂防治棉蚜，致使棉蚜对常用杀虫剂的抗性不断增长。如新疆 6 个棉区的棉蚜种群对噻虫嗪的抗性达到 122-1095 倍（帕提玛·乌木尔汗等，2019）。邯郸地区监测到棉蚜种群对阿维菌素的抗性达到 108.7 倍（党志红等，2019）。棉蚜的防治一直是亟待解决的问题，科学合理地使用杀虫剂可以延长杀虫剂使用寿命。如将新一代鱼尼丁受体作用剂类杀虫剂溴氰虫酰胺与传统杀虫剂交替使用防治棉蚜，减缓棉蚜对杀虫剂产生抗药性的速度。
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1.2 溴氰虫酰胺
1.2.1 鱼尼丁受体
Ca2+能够参与细胞内诸多化学反应，包括调节肌肉正常收缩、进行信号传导等，是细胞内最重要的第二信使之一。因此 Ca2+浓度的维持，是保证生命正常运作的必要条件。鱼尼丁受体（Ry R）是一类非电压门控钙离子通道，能特异性地与植物碱鱼尼丁结合，故名鱼尼丁受体。Ry R 主要存在于细胞质的内质网和肌浆网上（二者在细胞内负责钙离子的储存和释放），是细胞内两个 Ca2+释放通道之一（Meissner，1994）。Ry R 通过内质网和肌浆网释放 Ca2+到细胞质，传递细胞内外的刺激信号，以此来维持 Ca2+浓度的稳定进而保证生物体内环境的稳定。如图 1.1 所示，鱼尼丁受体是由四个相同的亚单元组成的四聚体分子，每个亚单元包含一个疏水的 N 端结构域和一个 C 端跨膜结构域（Isaacs et al.，2012）。形似球状的 N 端结构域存在于细胞质，四个 N 端组合在一起形成一个巨大的四瓣花形状；较小的 C 端结构域包含 4-12 个跨膜片段，同时释放 Ca2+的通道也存在于该区域（Radermacher et al.，1994；Serysheva et al.，1995；Takeshima et al.，1993）。Ry R 广泛存在于哺乳动物、鸟类、昆虫等生物体体内，是目前已知的最大的离子通道蛋白，分子量约为 2-2.5MDa（Sattelle et al.，2008）。研究发现哺乳动物体内 Ry R 有三种亚型，分别为 Ry R1、Ry R2、Ry R3，而在昆虫中仅发现一种鱼尼丁受体基因且与哺乳动物的鱼尼丁受体基因同源性很低（Bull et al.，1993）。如表 1.1 所示，果蝇鱼尼丁受体序列与其它脊椎或无脊椎动物鱼尼丁受体序列同源性只有 37%到 45%（Vázquez-Martínez et al.，2003）。图 1.2 为部分昆虫、线虫和脊椎动物鱼尼丁受体序列的系统进化树（Wang et al.，2012）。该系统进化树表明，昆虫的 Ry R 与脊椎动物和线虫是完全分离的。因此鱼尼丁受体作用剂类杀虫剂表现出显著的选择差异性，对哺乳动物等非靶标生物较为安全。
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第二章 溴氰虫酰胺抗性品系的选育，钠离子通道突变的筛选以及交互抗性测定
2.1 实验材料
2.1.1 棉蚜的饲养
本实验所用的敏感品系棉蚜（SS）与溴氰虫酰胺抗性品系棉蚜（CYR）均来自实验室，并一直在养虫室内培养。其中敏感品系是 2008 年采集于吉林省长春市郊外并在实验室内连续独立培养至今，期间未接触过任何药剂也未与任何其它品系混合。饲养棉蚜所用的棉花幼苗的培养方法如下：将统一规格的棉花种子浸泡在混有少量百菌清的水中，48 ℃存放 8 h 后用蒸馏水淘洗干净沥干后用浸湿的脱脂棉包裹重新放回 48 ℃温箱。而后每隔 4 h 查看种子的湿润程度，避免因水分蒸发导致种子被烘烤失去活性。16 h 后待种子发芽，将种子种入事先灭好菌的土中（营养土与蛭石按 3:1 比例配好），4-5 d 等到棉花幼苗破土且茎秆长度在 10 cm 左右，轻轻拔出并清洗干净放入营养液中水培备用。人工智能养虫室的培养条件为，温度 20-23 ℃，光周期 16:8 h（L:D）。
2.1.2 实验试剂与仪器
百菌清、丙酮（北京化工厂）、乙醇、10%溴氰虫酰胺悬浮剂、98%灭多威原药、96%吡虫啉原药、96%噻虫嗪原药、97.8%啶虫脒原药、96.2%杀扑磷原药、97%乙酰甲胺磷原药、97%毒死蜱原药、22%氟啶虫胺腈悬浮剂、96.8%联苯菊酯原药、98%溴虫腈原药（山东华阳农药化工集团有限公司）、95%氟氯氰菊酯原药、78.4%甲维盐原药、97%阿维菌素原药、96%呋虫胺原药、96%噻虫胺原药、75%氧化乐果乳油（河北新兴化工有限责任公司）、96% α-氯氰菊酯原药、95%顺式氰戊菊酯原药、97%功夫菊酯原药、增效醚（PBO）、磷酸三苯酯（TPP）、马来酸二乙酯（DEM）、TritonX-100、琼脂粉、异丙醇、液氮、ddH2O、西班牙琼脂糖（Biowest）、2× Rapid Taq Master Mix、引物（Ag-F、Ag-R、Kdr-F、Kdr-R）、EB 替代染料（中美泰和生物技术北京有限公司）、DNA Marker DL2000；
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2.2 实验方法
2.2.1 筛选品系
将待筛选的有虫苗整株倒置浸入事先配好的溴氰虫酰胺溶液中，约 15s 后取出，注意要轻轻操作避免因为叶片的抖动致使棉蚜脱落影响实验。
2.2.2 生物测定方法
使用传统的叶片药膜法测定溴氰虫酰胺的 LC50 时，无法获得较好的线性关系，因此选用系统性生物测定方法，其它种类杀虫剂的交互抗性测定仍使用叶片药膜法，具体方法如下。
2.2.2.1 系统性生物测定
首先将配好的按梯度稀释的药剂倒入如图 2.1 所示的玻璃瓶，然后将棉花幼苗茎秆剪成 10 cm 左右长度并插入事先打好孔的橡胶圆片，再用 Parafilm 封口膜将圆片与如图 2.1 的玻璃圆瓶封好防止蚜虫爬入瓶内影响实验结果。最后用毛笔小心地转移敏感与抗性的棉蚜（选用无翅成蚜）到叶片上，每株叶片挑25-30 头棉蚜。挑好后用带透气孔的塑料杯罩在玻璃杯上，每个浓度设置三个重复，并设置一组空白对照即瓶中装入超纯水替代药剂。72 h 后查结果并记录死亡率。本方法是参考（Grávalos et al.，2015）并结合实验室具体情况设计出的。
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第三章 溴氰虫酰胺抗性和敏感品系棉蚜转录组分析...........................29
3.1 实验材料................................29
3.1.1 实验昆虫...................................29
3.1.2 试剂和仪器................................29
3.2 实验方法...................................30
3.2.1 CYR 和 SS 棉蚜的转录组测序和数据分析.................................... 30
3.2.2 CYR 和 SS 品系棉蚜总 RNA 提取........................................32
3.2.3 CYR 和 SS 品系棉蚜 c DNA 合成......................... 33
第三章 溴氰虫酰胺抗性和敏感品系棉蚜转录组分析
3.1 实验材料
3.1.1 实验昆虫
本实验中所用的溴氰虫酰胺抗性和敏感品系棉蚜均来自实验室，具体饲养和筛选的方法详见第二章。
3.1.2 试剂和仪器
液氮、DEPC、RNAiso Plus、氯仿、异丙醇、无水乙醇、EB 替代染料（中美泰和生物技术北京有限公司）、西班牙琼脂糖（Biowest）、Oligo d(T) primer（50μM）、DNA Marker DL2000、dNTP mixture（2.5mM）、RNase-free water（上海生工生物股份有限公司）、5× PrimeScriptⅡ Buffer、RNase Inhibitor、Prime SuptⅡ R-Tase、SGExcel Fast SYBR qPCR（含 ROX）、EF1α、GAPDH、ddH2O（sterile distilled water）、物由上海生工生物股份有限公司合成；
超净工作台（苏净集团安泰公司）、无 RNA 酶离心管、无 RNA 酶 pcr 管、无 RNA 酶枪头（Ta Ka Ra）、--80 ℃冰箱、匀浆器、锡箔纸（北京鼎国昌盛公司）、通风橱、灭菌锅、-20 ℃冰箱（青岛海尔集团）、4 ℃冰箱（青岛海尔集团）、低温超速离心机（Sigma）、QL-901 型涡旋震荡仪（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）、Nanodrop2000、PCR 仪（Thermo Fisher）、ABI 7500 PCR仪（Applied Biosystems）、电泳仪、凝胶成像仪(Bio-RedTM)，移液枪（Eppendorf），热空气消毒箱（上海一恒科技有限公司）。
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结论
1. 建立稳定的溴氰虫酰胺抗性品系（CYR），并以 CYR 品系为材料测得了其对其它种类杀虫剂的交互抗性。与 SS 品系相比，CYR 品系对氟氯氰菊酯产生中等水平交互抗性。对α-氯氰菊酯、乙酰甲胺磷和吡虫啉产生了低水平的交互抗性。在中等抗性水平下，细胞色素 P450 参与棉蚜对溴氰虫酰胺的解毒代谢过程。且 P450 代谢的增强和 M918L 基因突变是敏感品系棉蚜对菊酯类杀虫剂极不敏感的主要原因。
2. 相对于 SS 品系，CYR 品系中 P450、UGTs、GSTs 和 ABC 基因等 2016 个的基因差异表达。qPCR 显示 P450 基因在抗性品系中均过量表达。表明 P450基因 CYP6CY7、CYP6CY21、CYP6C12、CYP4CJ5、CYP380C6、CYP380C12可能与棉蚜对溴氰虫酰胺产生抗性相关。
参考文献（略）