第一章 绪论
1 玉米纹枯病及茎腐病的研究现状
1.1 玉米纹枯病的研究现状
1.1.1 玉米纹枯病的发生及危害
玉米纹枯病(Maize sheath blight)又名玉米尖眼斑病(Sharp eyespots of maize)和花脚杆病，1966 年我国吉林省出现首例玉米纹枯病，进入 20 世纪 70 年代后，我国的玉米种植面积逐渐扩大，高密度种植单一高产杂交种，与此同时，玉米纹枯病发展不断加快，逐渐发展成为我国玉米的主要病害，在我国的辽宁、河南、山东、山西、河北等多个省份的玉米产区广泛蔓延开来，一般年份的发病率甚至可以达到 70%-100%。在美国、俄罗斯、日本、南非等地也屡见报道，正在逐步发展为世界性的玉米病害[4]。
玉米纹枯病主要为害玉米的叶鞘部分，病情严重时会为害茎秆甚至波及果穗。病情初期的症状主要体现在茎基部的 1-2 节，1-2节叶鞘产生深绿色水渍样斑点，斑点扩散融合后会呈现出云状病斑，病斑颜色整体为灰褐色，边缘处颜色加深。随着病情的发展，病斑数量增多，并向植株上部蔓延，病斑扩散到穗包叶后引起果穗的秃尖、籽粒干瘪或腐烂，病情严重时会使得植株的茎基部以及根部失绿变白，次生根变色腐烂，夏季持续的高温、多雨过后会在发病部位看到细密的菌丝和褐色菌核[5-7]。由于该病害严重的损坏了茎部及根部的输导组织，影响了整个植株的养分和水分供应，轻则减产 10%-20%，严重时减产可达到 35%，给农业生产带来了极大损失。
1.1.2 玉米纹枯病的病原和病害循环
现有研究表明，玉米纹枯病的主要病原菌为立枯丝核菌（Rhizoctonia solani Kühn），该病原菌的生活史包含两个阶段：有性阶段为瓜亡革菌（Thanatephorus cucumeris (Frank) Domk），此时该菌属于担子菌亚门亡革菌属；无性阶段为立枯丝核菌，此时该菌属于半知菌亚门的的丝核菌属，该菌的菌丝融合群有许多种，但引发玉米典型症状的主要是立枯丝核菌的 AG-1IA 融合群，致病力很强，本次研究所使用的就是此菌株。该病原菌为多核结构，细胞核数量为 3 个或以上，菌丝细密，菌丝尖端聚集形成深褐色菌核[5]。
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2 玉米纹枯病及茎腐病的防治现状
2.1 选育和种植抗性品种
不同的玉米品种抗纹枯病的能力存在较大差别，通常情况下，高秆窄叶品种较矮秆阔叶品种抗纹枯病能力更强，晚熟品种也较早熟品种抗性强，近几年来金玉 506、中科玉 505、恩单 801 等玉米品种都具有较好的抗玉米纹枯病的能力，
Wu 等[21]报道的“花旺甜七号”甜玉米新品种对叶枯病抗性高，对叶鞘枯病具有中等抗性，但总体来说抗玉米纹枯病的种质材料相对缺乏，需要进一步挖掘抗性材料。
玉米茎腐病在发病前期无征兆，一旦发生防治十分困难，但进行病害调查时发现，同一区域不同玉米品种间发病率不同，也就是说不同品种对于茎腐病病原菌的抗性存在差异，抗病品种可以显著降低茎腐病的发病率从而较少生产损失[18]，因此，选育和种植抗病品种被作为防治玉米茎腐病的方法之一[23]。Leden?an 等[24]和 Santiago 等[25]以镰孢茎腐病为防止对象进行了种质资源的筛选，获得了一批抗禾谷镰孢菌（F. graminearum）的优质品种，最终培育出了抗病自交系 73405、73353、 Os 24-48 等。Afolabi 等[26]将 50 份具有较好抗病性的自交系材料在不同气候条件下进行了多年多地区的筛选，最后得到了 4 份高抗镰孢茎腐病的种质材料。岳辉等[27]在近几年对原有的优质杂交种亲本进行了筛选，最终得到了 DH25、S80、齐 319 以及 X717 等 9 份高抗病自交系[8]。
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第二章 生防菌株的分离与鉴定
1 实验材料
1.1 菌株及土壤
供试菌株：禾谷镰孢菌（F. graminearum）；立枯丝核菌（R. solani）；突脐蠕孢菌（S. turcica）；稻梨孢（P. oryzae）；核盘菌（S. sclerotiorum）；灰葡萄孢（B. cinerea），由本课题组分离保存。
土壤：取人参耕作层 2-20cm 之间松散湿润的土壤，放入塑封袋，4℃保存备用。
1.2 实验仪器和设备
恒温培养箱、旋涡混合仪、恒温摇床、电泳仪、PCR 仪、高速离心机、微型低速离心机、-80℃冰箱、-20℃冰箱、光学显微镜、电子天平、90cm 培养皿、酒精灯、锥形瓶、涂布棒、移液枪、打孔器、接种环、无菌牙签。
1.3 试剂及培养基
细菌基因组 DNA 提取试剂盒（TIANamp Bacteria DNA Kit）、琼脂糖凝胶回收试剂盒。
培养基：PDA 培养基；PD 培养基；LB 固体培养基；高氏一号培养基。
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2 实验方法
2.1 供试菌株的分离和纯化
称取潮湿松散的人参根际土壤 0.5 g，快速加入到 49.5 mL 无菌水中，用旋涡混合仪混合 5 min 使土样分散，此时便制备成 10-2 土壤悬液。用无菌移液枪吸取 10-2 的土壤悬液 1.0 mL，加入到 9.0 mL 无菌水中得到 10-3 土壤悬液，重复操作，最终得到 10-3-10-8 稀释液。取 10-7、10-8 的土壤稀释液各 500 μL，加入到 LB固体培养基平板上，用涂布棒将稀释液涂匀至吸收完全，取 10-5、10-6 的土壤稀释液各 500 μL，分别接入 PDA 平板上，涂布均匀至吸收完全，取 10-3、10-4 的土壤稀释液各 500 μL，分别接人高氏一号平板上，涂布均匀至吸收完全。28℃倒置培养 2-7 d。
从不同平板上挑取形态、颜色或质地具有代表性的单菌落分别划线在适宜其生长的培养基上，连续多次划线，28℃倒置培养，观察培养过程中各个处理菌落的颜色、表面光滑度、生长速度、透明度以及气味等方面的变化，纯化至产生菌落的各种性状均一致时，挑取单菌落，4℃保存备用。
2.2 生防菌株筛选及抑菌谱测定
2.2.1 生防菌株的筛选
采用平板对峙的方法进行生防菌菌株的筛选。依据纯化得到的供试菌株的分类将其分别接种在适宜其生长的培养基上（LB 固体培养基、PDA 培养基或高氏一号培养基），37℃倒置培养 1d，用灭菌后的牙签挑取单菌落接种于 PDA 培养基上距边缘约 1cm 处，进行定殖。将保存的禾谷镰孢菌（F. graminearum）接种到在 PDA 平板上，28℃活化 2-3 d，在菌丝未长满平板之前用直径 5 mm 的打孔器打取边缘菌丝的菌饼，将菌饼接种于供试菌株的对侧距离平板边缘约 1cm 处进行初筛，存在抑菌圈即保留。复筛时采用相同的方法，病原菌选用禾谷镰孢菌（F. graminearum）和立枯丝核菌（R. solani）。初筛过程中待测菌株较病原菌提前 1d 进行接种，复筛时待供试菌株菌落直径生长近 1cm 时再进行病原菌的接种。每次实验均需设置空白对照（只接种禾谷镰孢菌或立枯丝核菌），每个处理设置3 次重复。28℃恒温培养，不断观察供试菌株对禾谷镰孢菌和立枯丝核菌的抑制效果，待空白对照组菌丝长满平板时记录各组的抑菌效果和抑菌率。
第三章 GsBv1、Gs Al2 抑菌作用研究 ...................... 24
1 实验材料 .............................. 24
1.1 菌株 ..................................... 24 1
2 实验仪器和设备 ............................ 24
1.3 试剂及培养基 ................................ 24
第四章 生防菌株与玉米膜下滴灌水肥药一体化技术的联用 ............ 33
1 实验材料 ..................... 33
1.1 菌株 .................................... 33
1.2 实验仪器和设备 ............................ 33
1.3 材料及培养基 .................................. 33
第四章 生防菌株与玉米膜下滴灌水肥药一体化技术的联用
1 实验材料
1.1 菌株
供试菌株：立枯丝核菌（R. solani）；禾谷镰孢菌（F. graminearum）；贝莱斯芽孢杆菌（B. velezensis；GsBv1）； A. lannensis（GsAl2）。
1.2 实验仪器和设备
滴灌罐、膜下滴灌（管）带、高温灭菌锅、恒温培养箱、恒温摇床、电子天平、90cm 培养皿、酒精灯、锥形瓶、涂布棒、移液枪、打孔器、接种环、无菌牙签。
1.3 材料及培养基
材料：玉米种子（优迪 519）、高梁粒（带壳）、2%戊唑醇悬浮种衣剂。
培养基：PDA 培养基、PD 培养基；高梁培养基：将高梁粒洗净去除瘪粒，煮熟后装入锥形瓶（高梁粒体积不超过锥形瓶最大容量的 2/3），121°C 灭菌 15 min，放凉备用。
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结论
1. 以吉林省玉米纹枯病、茎腐病优势菌株立枯丝核菌（R. solani）和禾谷镰孢菌（F. graminearum）为供试菌，从多年生人参根际土壤中分离微生物，通对对峙培养及抑菌谱分析，筛选得到两株具有显著生防效果的菌株 GsBv1 和 GsAl2，通过生理生化、分子生物学鉴定及系统发育分析，确定 GsBv1 为贝莱斯芽孢杆菌（B.velezensis），GsAl2 为 A. lannensis。
2. 通过生防菌 GsBv1、GsAl2 对立枯丝核菌（R. solani）和禾谷镰孢菌（F. graminearum）菌丝生长、菌丝细胞膜渗透性、菌丝脂质过氧化程度的影响探究抑菌作用。结果表明，GsBv1、GsAl2 发酵液均显著抑制立枯丝核菌（R. solani）和禾谷镰孢菌（F. graminearum）菌丝生长，菌丝发生改变，菌丝脂质过氧化程度显著提高，细胞膜渗透性增强，菌丝脂质过氧化程度提高，能够显著抑制病原菌菌体活性。
3. 将 GsBv1、GsAl2 与玉米膜下滴灌水肥药一体化技术联用，对纹枯病、茎腐病进行综合防控。结果表明，GsBv1 对玉米纹枯病的田间防效为 69.64%，对玉米茎腐病的田间防效为 47.64%；GsAl2 对玉米纹枯病的田间防效为 52.34%，对玉米茎腐病的田间防效为 58.68%；生防菌的施用未增加玉米的表观病害。上述结果表明将生物防治与膜下滴灌水肥药一体化技术联用防控玉米纹枯病、茎腐病等土传病害切实可行。
参考文献（略）