第 1 章 前言
1.1 盐碱对植物的伤害
土壤盐碱化的加剧将会使得耕地面积日益减少，作物的质量和产量下降。世界上有 8.31 亿公顷的土壤受到过高盐碱度的影响[1]。其中，碱土（碱性）为 4.34亿公顷，盐碱土为 3.97 亿公顷[2]。土壤中的盐分主要是因为 NaCl 的积累，而碱土则主要因为 Na HCO3 和 Na2CO3 的积累[3]。根据有关专家的预测，到 2050 年，发生盐碱化土地的比例将会达到 50%，将严重影响人们对土地的利用率以及作物的产量和质量[4]。盐碱胁迫中对植物的危害程度最大的就是盐碱胁迫，其次是碱胁迫和盐胁迫[5]。盐碱等非生物胁迫会造成渗透势降低、离子紊乱等多种危害，影响植物的生长发育，甚至导致植物死亡。因此，随着胁迫对植物的影响不断加重，对植物非生物胁迫的研究受到越来越多的关注。
1.1.1 渗透胁迫
当土壤中的盐碱含量过高时，土壤溶液的渗透势就会下降，水分会从水势高的地方流向水势低的地方，在这种情况下，植物获得水分的难度就会增加，容易形成植物生理干旱，使得植物生长受到抑制，甚至导致死亡[6,7]。因此，渗透胁迫又被称为生理干旱。当盐碱对细胞产生渗透胁迫，就会破坏细胞内的生理平衡，造成植物缺水，需要通过渗透调节适应胁迫来提高植物应对胁迫伤害的能力[8-10]。
1.1.2 离子毒害
在正常的成长条件下，植物体内会保持较低的Na+离子浓度和较高的K+离子浓度的动态平衡。当植物受到盐碱胁迫时，在盐碱离子的作用下，这种动态平衡将被打破，盐碱离子会占用了其它离子的进出通路，导致植物矿物质的吸收出现障碍，对产量与质量产生影响。一旦Na+浓度过高，植物对K+、Ca2+和Mg2+的吸入速率及运输速率会有明显降低[10-12]。Ca2+含量的降低，会使生物膜遭到破坏；Mg2+含量的降低，会使叶绿素合成受到抑制，光合效率降低。离子的缺失和渗透的失衡，会导致光合作用的酶活性降低，抑制植物的光合和呼吸作用，使其难以继续成长至成熟，最终导致植物死亡[10-15]。
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1.2 植物对盐碱的响应
1.2.1 渗透调节
当植物受到盐碱胁迫时，外界环境中的高强度盐分迅速渗入细胞，导致根部细胞外水势明显低于细胞内水势，使得植物根系难以吸取周围水分，引起胞内水分外渗，造成内部严重缺水。为保证细胞内水分平衡，植物必须提高细胞液浓度，利用体内积累的有机物质或是外部环境吸收的无机离子来降低自身的渗透势，维持细胞正常状态以及各项代谢活动，这种现象称为渗透调节[19]。
在植物体内有无机离子和有机溶质两大类物质能够参与植物非生物胁迫过程。无机离子包括 K+、Ca2+、Cl-、无机酸盐等；有机溶质包括甘露糖、脯氨酸、甜菜碱、有机酸、可溶性糖等。渗透调节物质的积累，将有效调节植物的渗透势，从而在非生物胁迫中发挥作用[16]。
1.2.2 离子转运与动态平衡
离子能够参与植物生长发育的诸多过程，盐碱胁迫会导致植物细胞内离子紊乱，从而造成诸多危害，影响植物生长发育。在调节植物体内pH的过程中，有机酸和无机离子能够起到主导作用[20]，通过分泌有机酸，调节体内及根外的pH，保护根系不受碱害。盐碱胁迫下会造成Na+的大量积累，损坏细胞的膜系统，而K+可以降低植物细胞渗透势，维持水分平衡。植物可以通过限制Na+进入，吸收K+来维持细胞的高K+/Na+值以保证正常的生理代谢[21]。此外，Ca2+参与植物响应各种胁迫环境，Ca2+浓度的增加也会限制Na+进入，有助于维持细胞的动态平衡，从而完成对逆境的适应[22,23]。
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2.1 试验材料
2.1.1 试验菌种
苦豆子 c DNA 酵母表达文库、大肠杆菌 DH5α和酿酒酵母 INVSC ?由实验室保存。
2.1.2 试验试剂
酵母质粒提取试剂盒购自 Sangon 公司。
胰蛋白胨和酵母提取物从 OXOID 公司购入；琼脂糖从 BIOWEST 公司购入；Yeast Minimal Media-SD Base 和-Ura Do supplement 从 TAKARA 公司购入。
2.1.3 主要仪器设备
（1）PCR 自动系列化分析仪；（2）超净工作台；（3）高速台式离心机；（4）电热恒温水浴锅；（5）恒温摇床；（6）凝胶成像分析系统。
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2.2 试验方法
2.2.1 筛选浓度确定
向 YPDA 固体培养基中加入不同浓度的摩尔比为 1:1 的 Na2CO3和 Na HCO3，吸取适量的文库菌液，涂布在筛选的平板上，30°C 倒置培养 2-4 天，观察酵母生长状况，并跟据酵母的生长情况，逐步确定最终的筛选浓度。
2.2.2 文库菌液筛选
吸取适量的文库菌液，涂布 SD/-Ura 培养基(含 0.0026 mol/L 1:1 的 Na2CO3和 Na HCO3)，30°C 倒置培养 2-4 d，用灭菌后的枪头将筛选得到的酵母单菌落接种在 SD/-Ura 液体培养基(含 0.0026 mol/L 1:1 的 Na2CO3 和 Na HCO3)中，在 30°C条件下 230 rpm 振荡培养 14-16 h。
2.2.3 酵母质粒的提取
（1）将培养好的酵母菌液 60°C 水浴 2 h。
（2）取 2-5 mL 酵母菌液于离心管中，8000 rpm 离心 2 min，弃上清；
（3）向离心管中先后加入 600 μL 酶解缓冲液、1.2 μL β-巯基乙醇和 50 μLSnailase，在 37°C 条件下水浴 3 h；
（4）5000 rpm 离心 10 min，弃上清，再加入 250 μL Solution I，用涡旋振荡器涡旋菌体；
（5）加入 250 μL Solution II，上下温和颠倒混匀，静置 2 min；
（6）加入 350 μL Solution III，上下温和颠倒混匀，12000 rpm 离心 15 min；
（7）将上清液加到吸附柱中，室温条件下静置 2 min，8000 rpm 离心 2 min，倒掉管中废液后放回吸附柱；
（8）加入 500 μL Buffer DW1，10000 rpm 离心 1 min，倒掉管中废液后放回吸附柱；
（9）加入 500 μL Wash Solution，10000 rpm 离心 1 min，倒掉管中废液后放回吸附柱，12000 rpm 离心 2 min；
（10）将吸附柱放入空的 1.5 mL 离心管中，悬空滴加 50 μL Elution Buffer到吸附柱膜上，室温条件下静置 2 min，
10000 rpm 离心 1 min；
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第 3 章 SaENO2 基因的克隆及生物信息学分析...........................16
3.1 试验材料......................... 16
3.1.1 酶及试剂................................ 16
3.1.2 引物及测序................................ 16
第 4 章 SaENO2 基因功能的初步分析......................................24
4.1 试验材料..................................... 24
4.1.1 植物材料....................................... 24
4.1.2 试验试剂.................................... 24
第 5 章 SaENO2 基因在酵母和拟南芥中的功能验证.........................30
5.1 试验材料..................................... 30
5.1.1 试验菌种及种子.................................. 30
5.1.2 试验药品及试剂........................ 30
讨论
本试验通过对苦豆子 c DNA 酵母表达文库筛选，获得了抗碱相关基因，即苦豆子 SaENO2 基因。通过对 SaENO2 基因的生物信息学分析，对其进行初步功能预测。结合相关研究可知，烯醇化酶除了参与糖酵解过程之外，还对植物的生长发育具有重要作用，能够参与植物逆境响应。同时，也有研究表明烯醇化酶与细胞的增殖和凋亡有关。由此推测 SaENO2 基因极有可能与苦豆子抗逆有关，
SaENO2 基因可能参与非生物胁迫下的细胞凋亡过程，但对于 SaENO2 基因如何调控细胞凋亡、细胞凋亡过程是否与非生物胁迫响应有关及其他情况下细胞凋亡过程还需要进一步研究。
由于苦豆子基因组没有完成测序，且本研究在我们通过筛选所获得的基因序列中没有获得其启动子序列，这对于我们研究苦豆子烯醇化酶基因在苦豆子中的功能具有一定的局限性，因此在对苦豆子烯醇化酶基因的研究中，并未通过 35S启动子过表达来探究该基因在苦豆子应对逆境中的作用。本研究对苦豆子进行盐、碱和干旱处理后，探究烯醇化酶基因的表达情况，我们发现该基因在胁迫处理后表达量出现不同程度上调，这说明我们有必要进一步研究苦豆子烯醇化酶基因的上游启动子及其顺式作用元件的功能，分析与逆境胁迫响应相关的特殊元件，可以通过克隆基因的启动子，并进行相关调控元件的分析。
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结论
本研究以多年生草本植物苦豆子为材料，利用摩尔比为 1:1 的 Na2CO3 和Na HCO3 模拟碱胁迫筛选苦豆子 c DNA 酵母表达文库，得到了苦豆子烯醇化酶基因 SaENO2。通过基因重新转入酵母 BY4743 和拟南芥中过表达 SaENO2，验证了 SaENO2 基因的功能。本研究主要得到以下结论：
1. 利用 0.0026 mol/L 摩尔比为 1:1 的 Na2CO3和 Na HCO3对苦豆子 c DNA 酵母表达文库进行筛选，共得到了 9 个抗碱单克隆，经过生物信息学分析，选取候选基因，最终得到了 1 个抗碱相关基因，命名为苦豆子烯醇化酶基因（SaENO2）。
2. SaENO2 基因全长 1909 bp，去载体序列后长 1835 bp，ORF 为 1335 bp，编码 444 个氨基酸，基因编码的蛋白质分子量为 47.74 KDa，基因的等电点 pI为 5.70。其氨基酸序列与大豆的同源基因的相似度为 95.72%，与拟南芥的同源基因的相似度为 88.06%。系统进化树分析表明，SaENO2 与绿豆和赤豆同源基因的亲缘关系最近。
3. 利用实时荧光定量 PCR 检测苦豆子的根、茎和叶片中，SaENO2 基因在对照、1.2% Na HCO3、1.2% Na Cl 和 8% PEG 处理 72 h 后表达量的变化。结果显示：SaENO2 基因的表达量在茎中最高，其中在 1.2% Na HCO3 处理下的茎中最高；与对照相比，基因在 1.2% Na HCO3、1.2% Na Cl 和 8% PEG 处理下表达量均上调，在 1.2% Na HCO3 处理下上调最多，8% PEG 次之。SaENO2 基因表达量的上调说明 SaENO2 基因能够响应非生物胁迫。
4. 利用烟草进行了亚细胞定位分析，结果发现：SaENO2 基因在胞质和核中均有表达。
5. 苦豆子 SaENO2 基因重新转入酵母 BY4743 中，以野生型为对照，观察野生型和转基因酵母的生长状态。结果表明：在 Na Cl 和 Na HCO3 处理下，转基因酵母长势明显好于对照，且 Na HCO3 处理下的效果更加显著。说明 SaENO2能够提高酵母对盐碱的耐受能力，且耐碱性更强。
参考文献（略）