第 1 章 综 述
世界上的其它国家和地区的银杏大多是从我国引进。银杏作为药用在我国已有 5000 多年的历史。据《本草纲目》记载，银杏种仁入药具有润肺止咳的功效，叶具有敛肺平喘、止遗尿、止白带及镇咳止喘、清热利湿的功能，可用于治疗肺病咳嗽、哮喘等[1,2]。银杏叶提取物（extract ofginkgobiloba EGB）是从银杏的干燥叶中提取的有效成分。继发现银杏叶主要有效成分银杏黄酮和银杏内酯具有防治心脑血管病和神经系统疾病的作用后，关于其有效成分分析及其药理作用有了较多的研究，已成为国内外研究和应用的热点。上世纪 70 年代，法国、德国研制出了银杏叶提取物，应用化学分析方法发现 EGB 中的多种生物活性物质如银杏黄酮甙、银杏内酯等，并进行了广泛药理学研究，为银杏的开发应用提供了基础[3]。德国 Schwabe 制药公司于 1991 年就银杏叶提取物申请了专利，代号 EGB761，其质量标准（国际标准）为银杏黄酮≥24%，银杏内酯>6%[4,5]。德国培尔公司生产出银杏提取物注射液“金纳多”，对银杏叶提取物制剂的开发和临床应用起到了巨大推动作用。
1 银杏提取物主要化学成分
银杏叶提取物中主要富含两类生物活性成分，一类为生物黄酮，一类为萜类内酯 。银杏叶中黄酮类化合物的含量为 22%-27%，是EGB中的重要活性成分，也作为EGB制剂的国际标准（银杏黄酮≥24%），由33种黄酮组成，主要是单黄酮、黄酮醇、双黄酮及儿茶素类等。其含量排在前位是槲皮素（quercetin）、山奈酚（kaempferol）、异鼠李素（isohamnetin）。黄酮类化合物具有3, 3, 4三羟基结构, 具有很强的生物活性。其中槲皮素生物活性最强[6,7]。
另一类主要活性成分是银杏内酯，也作为EGB制剂的国际标准（银杏内酯>6%）。包括6种萜内酯单体，其中一种为白果内酯（属倍半萜内酯），另5种分别为萜内酯A、B、C、J、M（均为二萜内酯），萜内酯A、B、C、J、M是血小板活化因子（PAF）受体拮抗剂，其中萜内酯B活性最高[8]。此外还含有白果酸、氢化白果酸等，是EGB中的毒副作用成分，可能与致过敏有关，其含量控制在 5 μg/mg 以下。
2 银杏叶提取物主要药理作用和实验研究
2.1 清除氧自由基抗氧化作用
银杏叶提取物清除氧自由基抗氧化作用主要取决于银杏黄酮，银杏黄酮作为自由基吸收剂而起到抗氧化作用。银杏黄酮在化学结构上具有不饱和键，可作为供氢体与自由基结合，本身转变为酚基自由基。阻止了自由基与脂类物质结合为脂类化合物自由基。由于酚基自由基的相对的稳定性降低了自动氧化链式反应的传递速度，从而抑制进一步被氧化。生理情况下机体内自由基的产生和清除保持着动态平衡，一方面自由基的产生在机体新陈代谢过程中起着重要作用。一方面过多的自由基将引发氧自由基反应和脂质过氧化反应，是造成细胞膜脂质过氧化损伤和细胞老化、DNA 变异等的重要原因。因此如体内自由基产生增多或者清除不足，都会引发一系列的自由基链锁反应，导致代谢失常和免疫功能降低，从而诱发包括恶性肿瘤在内的疾病[9]。银杏叶黄酮能清除自由基，抑制脂质过氧化反应，提高体内超氧化物歧化酶（SOD）的活性，并且其清除自由基的活性随着银杏叶提取物有效成分的浓度增加而增加，这表明银杏叶提取物可通过清除自由基起到防治疾病和抗衰老的作用。该方面的研究较多，如 D-半乳糖是实验中常用的制造动物衰老模型的实验药物[10,11]。D-半乳糖是一种生理性还原糖，在正常代谢中经半乳糖转移酶催化转变为葡萄糖参与代谢。如给实验动物短期内过量供给，则在半乳糖氧化酶的作用下生成乙醛糖和过氧化氢，代谢过程中产生活性氧增多，氧自由基引发脂质过氧化，导致包括脑细胞在内的一系列细胞膜损伤。同时细胞膜脂质过氧化产物代谢产物丙二醛（MDA）还可与 DNA、RNA 以及大分子物质蛋白质和磷脂等结合，使膜成分改变，从而促进脑细胞等细胞凋亡的发生导致机体衰老。李利平[12,13]等连续应用 D-半乳糖造成昆明鼠衰老模型，并同时应用不同剂量的银杏叶提取物腹腔注射，连续 8 周后观察各组小鼠血浆脂质过氧化物 MDA 浓度和脑细胞凋亡水平等。结果表明，衰老模型组小鼠血浆中 MDA 水平、脑细胞凋亡水平均明显高于各银杏叶提取物组；此外模型组老鼠出现明显的生理老化现象，如毛色稀疏，胡须脱落参差不齐，躬背、弯腰，行动迟缓，步态蹒跚，皮下脂肪薄、体重低等，模型组小鼠学习记忆能力明显降低，说明银杏叶提取物可以通过清除自由基、减轻脂质过氧化等作用防止或减轻细胞损伤，保护学习记忆，减缓衰老进程。博莱霉素(BLM)是临床常用的抗肿瘤药物，其杀伤肿瘤细胞的机理是导致体内超氧阴离子自由基或羟自由基的生成，进而引起肿瘤细胞 DNA 链断裂。该药物常用于动物实验中制造肺损伤模型 。许朝霞[14,15]等应用 BLM 经气管吸入造成 SD 大鼠的肺损伤模型，造模后，应用 EGB 连续腹腔注射。于第 7、14 和 28d 取各组肺组织进行羟脯氨酸含量测定及形态学检测和肺泡Ⅱ细胞凋亡率。结果银杏叶提取物组肺组织羟脯氨酸含量明显低于模型，Ⅱ细胞凋亡明显低于对照组，可能与其有效清除 BLM 引起的氧自由基，减轻肺泡上皮细胞膜损伤有关。心肌缺血-再灌注损伤是临床常见的病理过程，氧自由基损伤是再灌注损伤的重要机制，张明艳[16]等通过复制家兔心肌缺血与再灌注损伤模型，发现应用银杏叶提取物制剂可有效地减轻家兔心肌缺血与再灌注损伤的程度。表现为用药组在心肌缺血一定时间后复灌，再灌注心律失常发生率明显低于对照组。电镜下用药组心肌结构基本正常，肌节排列整齐、线粒体脊排列比较整齐。采用犬急性心肌梗死模型，观察应用 EGB 对急性心肌缺血的影响，结果表明 EGB 可明显减小犬心肌梗死范围；采用脑垂体后叶素持续灌注复制大鼠急性心肌缺血模型,结果表明应用EGB 可减轻心肌缺血性损伤[17]；并能降低实验鼠缺血心肌和血清中 LDH、MDA 含量，升高 SOD 水平；降低心肌细胞凋亡阳性率。可能与 EGB 有效清除再灌注损伤组织自由基产生有关[18]。
第 2 章 实验研究........................... - 15 -
前言..........................................-15-
1 材料 .......................................- 15 -
1.1 实验动物...................................- 15 -
1.2 实验材料......................................- 16 -
2 实验方法 ..................................- 16 -
3 实验结果....................................- 18 -
4 讨论 .......................................- 22 -
5 结论 ........................................- 24 -
第 2 章 实验研究
前言
恶性肿瘤目前已成为人类主要死亡原因之一[1]，其主要治疗措施之一是化学药物治疗，化疗药在杀伤肿瘤细胞的同时对正常组织有不同程度的损伤，迫使许多病人放弃治疗；同时随着用药，肿瘤组织产生对化疗药物的多药耐药性也降低了疗效。所以寻找能既能抑制肿瘤生长又对正常组织损伤较小的药物，或能增强化疗药物抗肿瘤活性、降低化疗药耐药的药物很必要[2,3]。近年来从天然药物中筛选抗肿瘤药物是抗肿瘤研究领域之一。植物黄酮类化合物具有广泛的生物活性，如心血管保护、抗炎、抗过敏、抑制神经功能衰退等。其抗癌作用研究也成为研究的热点[4,5]。对植物黄酮类化合物研究显示槲皮素单体具有较强的抗肿瘤活性，能抑制肿瘤细胞生长，逆转肿瘤细胞对化疗药物的多药耐药，增强化疗药物活性，并且在有效抗肿瘤浓度范围对正常组织基本无损害；可以逆转 KB-MRP 瘤株对阿霉素、依立替康、长春新碱、环磷酰胺等多药耐药，其逆转机制可能与 MRP1 的表达下调有关。对长春新碱、柔红霉素、5-Fu的细胞毒性有增敏作用[6,7,8]等。因此认为槲皮素具有有效抗肿瘤作用，且较符合上述化疗药要求[9]。但单一成份槲皮素提取成本高难以临床推广。作为槲皮素天然储存源的银杏叶资源丰富，有效成份提取成本低，银杏总黄酮及槲皮素提取率很高。银杏黄酮作为类黄酮物质其清除自由基等作用是肯定的。本实验中所用高槲皮素黄酮苷银杏叶提取物注射液为经工艺改进后制得的银杏叶提取物注射液，银杏黄酮（包括槲皮素、异鼠李素、山萘酚等）占提取物的 49%，其中槲皮素所占比例最高（占提取物总量的31%，即 440.5ug/ml）。因此研究该制剂对抗肿瘤作用及机制具有一定的实用价值[10]。
本实验旨在观察高槲皮素黄酮银杏注射液（以下简称 HQGBE 注射液）对荷瘤小鼠（H22）肿瘤生长的抑制作用及其对环磷酰胺杀伤荷瘤鼠肿瘤的增效作用；并初步探讨其免疫机制。
1 材料
1.1 实验动物
清洁级昆明小鼠，体重 18~22g，雌雄兼用，购自河北医科大学实验动物中心，动物饲养环境为温度 20～23℃，相对湿度 40%～70%，光照 12h/d，自由饮水、饮食。
1.2 实验材料
1.2.1 试剂与仪器
HQGBE 注射液：是将银杏叶粗提物经过沉淀、抽滤、真空冷冻干燥等工艺制得EGB 纯化品，再经注射用水溶解、分装灭菌等制备成为注射液。每 5ml 中含总提取物17.5mg。经 HPLC 测定分析（江苏艾博药业），银杏黄酮 8.71mg，占提取物的 49.7%，其中槲皮素含量为440.5 g/ml，占总黄酮的47.3%；萜内酯0.81mg，占提取物的4.62%，其中萜内酯 B 为 1.52%.。
2 实验方法
2.1 动物模型制作
小鼠肝癌 H22 瘤株，经腹腔传代接种。待腹水生长至 7 天，采用颈椎脱臼处死后，将小鼠固定于实验板上，抽吸腹水，用无菌生理盐水稀释、混合并制备瘤细胞悬液，显微镜下调整肿瘤细胞浓度为 1×107/ml 备用。
取昆明种小鼠，于右前肢腋窝下碘伏常规消毒，每只小鼠腋窝皮下注射瘤细胞悬液 0.2ml[ 11]，制作实体瘤模型。
2.2 分组、给药及检测指标
2.2.1 HQGBE 注射液对 H22荷瘤鼠 7 天用药抑瘤作用研究
取小鼠 40 只，按动物模型制造方法接种 H22 瘤细胞悬液，造模成功后，于接种次日，称重后按体重将小鼠随机分为 5 组，即：模型对照组、HQGBE 注射液低剂量组（17.5mg/kg）、中剂量组（35mg/kg）、高剂量组(70mg/kg)、环磷酰胺阳性对照组（20mg/kg），每组 8 只。HQGBE 注射液各组和阳性对照组分别按照上述药物剂量给药，各组均采取腹腔注射给药，给药容积为 0.2ml/10g，模型组给予同等容积的 N.S，每日1 次，连续 7 日。于末次给药后 24h，颈椎脱臼处死小鼠，剥出瘤块，称重并称体重。
2.2.2 低剂量 HQGBE 注射液对环磷酰胺的增效作用
取小鼠 32 只，按照“动物模型制作”方法接种瘤细胞悬液。成功后于接种次日，将小鼠按体重随机分为模型组、环磷酰胺（5mg/kg）、低剂量 HQGBE 注射液（17.5mg/kg）组、联合用药组（环磷酰胺 5mg/kg+HQGBE 注射液 17.5mg/kg）。共 4 组，每组 8 只。模型组、低剂量 HQGBE 注射液组、低剂量环磷酰胺组均采用腹腔注射给药，给药容积 0.2ml/10g，模型对照组给予 N.S。联合用药组给药途径，其中 HQGBE 注射液采用腹腔注射，给药容积均为 0.2ml/10g，环磷酰胺采用皮下注射给药，给药容积同上，每日 1 次，连续用药 7 日。于末次给药后 24h，采用颈椎脱臼法处死小鼠，剥出肿瘤瘤块称重，计算肿瘤平均重量及肿瘤抑制率。公式同上。
4 讨论
从天然植物中寻找抗肿瘤药物已经成为新药研发的重要方向。其中含植物黄酮类化合物的天然药物的抗肿瘤活性备受关注[10]。银杏叶作为黄酮含量丰富的天然植物，用作药物在我国已有 5000 年的历史。银杏叶提取物（EGB）是从银杏的干燥叶中提取的有效药用成分，由于其广泛的药用价值，已成为国内外研究和应用的热点，特别德国生产出“金纳多”银杏提取物注射液，对银杏叶提取物制剂的开发应用方面有了重大突破。银杏叶提取物 EGB761 为按照药典标准[12]制备的 EGB，有效成分银杏黄酮（≥24%）和银杏总内酯（≥6%）。银杏黄酮和内酯类具有广泛的生物活性，如银杏黄酮具有抗氧、抗辐射、抗肿瘤，增强免疫功能等药理作用[6,7,13]。近年来 EGB 也得到了临床认可，尤其是在治疗心脑血管疾病方面[14]。但是在抗肿瘤方面还仅限于实验研究。
本实验中使用的银杏叶提取物注射液，其黄酮含量高达 49.8%，槲皮素黄酮含量高达 440.5 g/ml，占总黄酮的 47.3%，故自命名为“高槲皮素黄酮银杏叶注射液”。鉴于槲皮素单体抗肿瘤活性的大量实验证据[15-20]，设计了本实验，目的是为了研究其含有多种银杏黄酮的提取物在实验动物体内抗肿瘤作用。实验结果表明，高槲皮素黄酮银杏叶注射液对肝癌 H22荷瘤小鼠的肿瘤生长有明显的抑制作用，用药 7 天时，抑瘤率可达 48.84%。此外，研究了高槲皮素黄酮银杏叶注射液对环磷酰胺抗肿瘤的增效作用。结果表明低剂量高槲皮素黄酮银杏叶注射液与环磷酰胺联用后，抑瘤率明显提高（34.8%），而此两种药物单独用药 7 天，其抑瘤率均低于 30%。可以认为高槲皮素银杏叶提取物是一种有效的化疗药物的增效剂，能有效减低化疗药物的使用剂量。因此可以认为将是较好的化疗辅助用药。研究还进一步探讨了高槲皮素黄酮银杏叶注射液对荷瘤小鼠体液免疫功能的影响，结果显示高槲皮素黄酮银杏叶注射液可以提高荷瘤鼠体内 IL-2 和 TNF-α 的浓度。研究表明银杏叶提取物可以提高某些病理状体下，体内 TNF-α 的浓度，从而发挥其生物活性，如王国栋[21]等研究结果也表明，银杏黄酮可以通过调节枯否细胞表达 TNF-α 发挥抗炎保护肝细胞的作用，刘继新[22]等研究结果也表明银杏叶提取物能提高佐剂性关节炎大鼠肿瘤坏死因子含量。 IL-2 和 TNF-α 在机体抗肿瘤效应中起着重要的作用。IL-2主要由活化的 CD4+T 细胞和 CD8+T 细胞产生，具有广泛生物活性，是所有 T 细胞亚群的生长因子，并可促进活化的 B 细胞增殖，故为调控免疫应答的重要因子，参与肿瘤的免疫监视、抗体反应等。TNF-α 主要由活化的单核/巨噬细胞产生，TNF 可以直接杀伤某些肿瘤细胞或抑制肿瘤细胞的生长，又能活化 NK 和巨噬细胞，间接发挥杀伤或抑制肿瘤的作用。并可通过损伤血管内皮细胞，促进血栓形成，导致肿瘤组织出血坏死[23,24]。银杏叶提取物抗肿瘤活性在国内也有报道， 研究表明[25,26]EGB761 能抑制黄曲霉毒素 B1 诱发 Wistar 大鼠肝癌的发生，杨涛[27]等报道 EGB761 能抑制或延迟黄曲霉毒素 B1 诱发 Wistar 大鼠肝细胞增生性病变，使增生结节即癌前病变的形成明显减少或推迟，抑制或延迟癌前病变向癌发展；可能通过下调 MXR7 蛋白表达，抑制经典 Wnt/β-连环蛋白通路的活性，降低大鼠肝癌发生和发展；EGB761 能够干扰 AFB1 致大鼠肝癌细胞增殖周期。
结 语
从天然药物中提取抗肿瘤活性的药物是抗肿瘤药物研究领域之一，银杏黄酮被认为是具有开发潜力的抗肿瘤成分。其中槲皮素抗肿瘤效果较好，对单一植物黄酮物质槲皮素的研究已经表明其抗肿瘤活性高，副作用低，并能逆转肿瘤细胞的多药耐药性，增强化疗药物抗肿瘤活性等。通过改进提取工艺可提高银杏叶提取物槲皮素含量。本研究使用的 EGB 提取物其槲皮素含量高。研究表明能有效抑制实验性荷瘤鼠肿瘤生长，提高免疫功能，增强化疗药物的抗肿瘤作用。并且长期用药能改善荷瘤鼠生存质量，且无明显毒副作用。本研究为该药的临床应用、为研制高效的银杏叶提取物以及单类成分的提取物提供了科学依据。因此提高我国对银杏叶相关药物制剂的研发工艺水平，生产高效的银杏叶提取物以及单类成分的提取物，可增强我国在同类产品的市场竞争力，为人类健康做出贡献。
参考文献（略）