第一章绪论
1.引言
肿瘤已经成为世界上主要的公共健康问题。肿瘤的高死亡率主要是由肿瘤诊断和治疗的几方面因素造成的。首先，由于缺乏有效的肿瘤早期检测手段，许多肿瘤目前只能在晚期被检测到。根据数据显示，多于70%的卵巢癌在确诊之前已经发生了转移或恶化。近来，多种成像模式，比如核磁共振成像(MRI)、正电子成像(PET)、计算机断层扫描(CT)、X射线照相和超声波成像，被广泛用于检测肿瘤区域的结构和功能变化。然而，这些传统成像模式的主要缺陷在于它们很难在病变与正常组织附近获得高对比度成像，同时也很难区分恶性肿瘤和良性病变，这主要是因为传统造影剂的肿瘤亲和力不足。另外，由于肿瘤耐药和严重的毒副作用，对那些癌症晚期或转移的患者来说，仅仅使用传统的治疗手段，例如化疗和放射，似乎是不够的。这两种治疗方法是使用细胞毒性药物或者放射的方式破坏肿瘤细胞。但是由于这些传统的治疗手段缺乏肿瘤特屏性，它们在肿瘤治疗期间会损害或者破坏健康组织和细胞。因此，传统的化疗和放疗会诱导许多局部甚至是全身性的副作用，例如严重的骨髓抑制和神经病变症状。有时甚至会因为送些严重的副作用而被迫中断治疗。另外，一些肿瘤细胞在化疗或者放疗阶段也会变得具有抵抗力。例如，在多次使用化疗药物后，细胞的P-糖蛋白上调，会促使细胞排出细胞毒葫物分子，从而减少肿瘤细胞内的药物浓度，运已经成为化疗耐受的一个重要原因。除了化疗外，肿瘤组织或细胞也会对放疗有抵抗力。高能量的放射线会破坏大部分的肿瘤细胞，但是一些残存的肿瘤细胞将会变成对放射治疗不敏感的肿瘤干细胞。这些肿瘤干细胞被认为是肿瘤复发的源头。
目前，近红外染料作为一种有前景的用于诊断和治疗肿瘤的成像治疗试剂，己经引起人们极大的兴趣。近红外染料会吸收特定波长的近红外光从而达到激发单线态，部分激发单线态的能量会以较长波长的光的形式释放出来，称为荧光。因此，近红外光可以有效地用于体内肿瘦成像。而且，肿瘤祀向的近红外分子具有高度特异性，可以区分肿瘤组织和正常组织。此外，由于在近红外光谱范围内，器官组织的自体荧光较低，以及组织对近红外英光吸收较低，因此近红外蒙光成像具有高敏感性，使背景干扰最小化，同时提高提高了组织穿透性。
另外一部分激发态的能量可W通过电子振动松弛或者其他非福射跃迁途径传递，转化为热。如果肿瘤组织内部热量产生的速率超过沮织的散热速率，那么抑瘤组织的温度将会逐渐地上升。当温度到达41.5°C时，就会对肿瘤细胞造成损伤。当温度超过43°C时，会引起肿瘤组织内部血管破坏。因此，近红外染料也可以用作光热治疗试剂。除了上面提到的两种能量传递途径外，激发态会通过系间窜越转移至一个具有较低能量的激发线态。在这个激发H线态，近红外染料可秀导巧性物质产生，例如自由基或者单线态氧。它们会引起附近生物大分子的氧化反应并造成机体组织的损伤。这里，产生的单线态氧是组织损害的主要原因。因而，近红外染料也可W作为有效的光动力试剂(图1-1)。和传统的方法相比，光热治疗和光动力治疗有不同的治疗机制。首先，鞭向的光热或光动力治疗试剂主动地蓄积在肿瘤位点，然后可W使肿瘤区域成像并且清楚地定位肿瘤位置。然后，肿瘤成像将引导激光治疗至肿瘤位点。同时治疗试剂产生的光热和单线态氧会破坏肿瘤区域细胞。因此，这两种治疗方法能够明显地避免耐药性和降低严重的全身副作用。近来，肿瘤光热治疗与光动力治巧已经成为肿瘤治疗中新的替代手段。
第二章近纽外染料在肿瘋成像和光热治巧中的应用
1.研究背景
体内的光学肿瘤成像对早期肿瘤诊断和治疗期间评估肿瘤治疗效应都有非常重要的作用。目前，非侵入性的光学成像方法无论是在临床还是临床前研究中都获得了巨大的关注。在这些诊断过程中，使用成像试剂靴向肿瘤组织，发出光学信号，从而有效地将肿瘤和正常组织区分开来。其中，肿瘤近红外荧光成像展示了巨大的潜力，因为在近红外光谱范围内荧光有较高的组织穿透深度和较低的沮织自体萊光干扰。静脉注射后，一旦受到激发，这些蓄积到肿瘤的荧光探针将会在肿瘤区域发出明亮的荧光信号。因而近红外荧光成像作为一种非侵入的和实时的成像方式，在沮织病理，特别是肿瘤的诊断方面，显现出其优势。肿瘤荧光成像的关键在于提高荧光探针对肿瘤组织特异性。尤其是，提高肿瘤和背景的信号的比值(T/B)吸引了许多研究者的注意。迄今为止，几种策略包括小分子鞭向近红外染料、近红外偶联物和可激活的近红外染料，都已经被用来提高肿瘤信号或降低背景信号。
2.小分子红外染料用于肿瘤荧光成像
具有髙T/B值的近红外染料才适合体内肿瘤成像。其中一条策略是开发具有主动蓄积在肿瘤组织的小分子黄光染料。目前，至少有两类近红外染料满足这种需求，分别是花菁类染料和四氮杂叶琳衍生物。首先，Zhang和他的同事[15]报道了一个花菁类染料，即旧-780视化物。送是一个具有优秀光学性质的近红外焚光染料，可用于肿瘤範向成像(图1-2A和2B)。体内IR-780贿化物的T/B值第1天达到2.0，到第20天增加到了7.0。然而，IR-780硕化物的强疏水性导致其在水溶液中只有极低的溶解度，这对广泛应用是非常不利的。Yang等人[17]报道了IR-783(图1-2C)，达是IR-780贿化物的衍生物，它有较好的亲水性，也可以选择性地蓄积在肿痛组织。据报道IR-783可W检测原位或转移瘤。与此相似的是，旧-808也被发现可以主动蓄积在肿瘤组织。旧-808与IR-7如破化物相比，分子中多了2个楼基，因而它的水溶性较好(图1-2)。IR-808和IR-780视化物相比，另外一个优势是它具有较低的系统性毒性。
2.2与肿瘤靶向配体偶联的近红外染稱用于肿瘤成像
具有肿瘤特异性的荧光探针对特定的肿瘤检测很重要。然而，大部分的近红外染料如ICG，是没有或者只有有限的肿瘤特异化这大大地限制了它们在肿瘤成像方面的应用。因此，不同的策略被用于提高近红外染料与肿瘤细胞之间的亲和为。将近红外染料和肿瘤特异性配体进行化学偶联是最常用的策略。这些配体包括RGD、抗体等，它们的受体在部分肿瘤细胞上过表达。由近红外染料和靴向配体组成的偶联物可以作为肿瘤特异性成像探针，增加体内成像的T/B值。
Chen等人[20]合成了一个近红外染料偶联物Cy5.5-RGD用于视向肿瘤成像。整合素是一个细胞跨膜粘附受体家族，在许多肿瘤细胞表面过表达，它的结合因子主要包含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)。因此小狀段RGD被研制成具有肿瘤祀向的特异性配体[21]。结果显示Cy5.5-RGD可W有效地靴向整合素avP3阳性的U87MG恶性胶质瘤。为了进一步提高视向能力，他们设计了一个RAFT的平台。RAFT有2个空间上独立的功能域，它可以被4个RGD分子和1个近红外染料分子(比如Cy5)同时以共价键地形式偶联(图1-3B)。据Zhao等人报道，Cy5-RAFT-c(RGD)4可W特异性地靴向到过表达的avps整联蛋白的HEK293肿瘤细胞中，而它不会蓄积在不表达avp3的HEK293移植瘤中。进一步地，Cy5-RAFT-c(RGD)4(图1-3B和3D)的T/B值明显高于Cy5-cRGD(图1-3A和3C）。还有其他报道也进一步地证实了这一现象。这些结果可能是因为4个RGD分子和1个探针偶联极大地增强了探针与肿瘤细胞表面特异性受体的亲和力。
迄今为止，将近红外染料和肿瘤鞭向配体偶联从而提高肿瘤将异性经过了广泛的研巧。除了分子範向，这些大分子配体也提高了近红外染料的半衰期和分布。总的来说，近纪外染料和配体的偶联可以使得近红外荧光染料作为具有肿瘤特异性的探针探针，并且明显的增加T/B化值。这些都使得近红外染料在肿瘤成像领域广泛应用。然而，仍然存在一些缺点需要优化，如一些配体的高成本和复杂的修饰过程。另外，在化学修饰过程中避免破坏配体结构和维持鞭向配体的亲和力也是千分重要的。
3.实验结果...................................89
3.1PMO-PAMAM-Ce6结合物的制备与表征...............89
3.2细胞吞噬...................................91
3.3PMO-PAMAM-Ce6conjugates在细胞内的分布..........92
3.4PCI介导的eGFP表达...............95
4.讨论...................................97
5.本章小结....................................100
第四章近红外染料在细胞内寡核苷酸递送中的应用
1.研究背景
目前，治疗用寡核巧酸，比如小干扰RNA(siRNA)和反义寡核苷酸(aWisenseoligonucleotides(ASOs))在许多疾病治疗中发挥作用[1-3]。剪接转换反义寡核苷酸(spliceswitchingoligonucleotides巧SOs))是一类新的寡核苷酸。SSO能够与目标的前体mRNA互补配对，阻碍其他的剪切因子的结合，调控选择性剪切的过程。目前，已经有多种SSO在临床前和临床中应用。比如，一个SSO能够调控Bcl-x基因的选择性剪化将Bcl-xL的前体mRNA转变为Bcl-xs的前体mRNA，诱导肿瘤细胞的凋亡。然而到目前为止，SSO作为治疗用寡核苷酸的进展比较缓慢化。其中一个比较大的障碍在于SSOs难W有效的递送到肿瘤细胞质和细胞核[10]。光化学内化(Photochemicalinternalization(PCI))通过光和光敏剂产生的单线态氧破坏溶酶体膜，是一种有效的溶酶体逃逸的手段。NobuhiroNishiyama指出，能否达到高效/低毒的PCI效果的关键在于光敏剂在细胞中的分布。如果光敏剂大量的分布于光毒性敏感的细胞器，如细胞膜和线粒体，将会造成严重的光毒性，而不是有效的寡核苷酸的光化学内化的效果。
PMO作为一类最广泛研究的第三代寡核苷酸，在体内外实验中表现出了出色的化学及体内稳定性[21]。PM0在临床前及临床试验中也表现出了明显的治疗效果。但是治疗过程中必须W非常离的给药剂量来获得阳性的治疗效果。难以进入细胞及难W从内涵体/溶酶体中逃逸出来是阻碍其临床快速发展的两个因素。要让PMO起效，必须将它们递送的细胞质中。一旦进入细胞质，PMO能够自由的扩散进入细胞核。为便于进入细胞，我们将PMO共价链接到带正电的PAMAM上。另外，PMO能够调控基因表达的前提是其能够从载体上解离下来，并与目标前体mRNA互补配对。因此，在共价较链的时候，我们选择还原环境敏感的二硫键来链接PMO与PAMAM。为有效的将PMO从溶酶体递送到细胞质，我们引入了光化学内化(PCI)，具体的是将光敏剂也联接到PAMAM上，获得PMO-PAMAM-Ce6。同时引入寡核苷酸和光敏剂，有如下优势：(1)同时增强细胞对寡核苷酸和光敏剂的吞權；(2)保证寡核苷酸和光敏剂在细胞内的分布一致；(3)避免光敏剂分布到光毒性敏感的细胞器中，如细胞膜和线粒体。送些优势为化毒/高效的PCI介导的寡核苷酸的细胞质递送提供了可能。
全文总结与展望
第一部分;首先突破传统的用聚合物包裹的方式増加IR780亲水性的思维，采用化学修饰的方法，合成了一个新型的两亲性近红外荧光分子，可以有效的应用于肿瘤的成像和光热治疗，而且安全性得到了一定程度的验证。此外，所获得的两亲性分子还可W作为一个近红外光敏感的纳米载体，用于递送疏水性药物，实现激光控制的药物释放，达到光热治疗和化疗联合的目的。接下来，我们需要进一步的完善巧G-IR7如-C13胶束递送疏水性药物紫杉醇的各项研巧，同时拓展其应用范围。
第二部分：本部分构建了一个具有肿瘤细胞帮向能力的光敏剂偶联物，解决了游离光敏剂的几个缺陷，如溶解度低，蛋白吸附和缺乏特异性等。光敏剂偶联物表现出了相当优异的进入肿瘤细胞的能力，在肿瘤的光动力治疗方面的优势尤为明显。在H维肿瘤组织，光敏剂偶联物同样的显示了其优越性，其肿瘤组织穿透性强。接着，我们希望进一步考察光敏剂偶联物RGD-P-Ce6是否能在动物水平显著提高RDT效果，并在组织水平上观察RGD-P-Ce6的穿透性。
第三部分：我们利用光敏剂偶联物来进巧寡核苷酸的细胞内递送，并且实现了激光控制基因的调控过程。树枝状聚合物能够高效的将寡核巧酸和光敏剂同时递送进入肿瘤细胞的溶酶体。寡核苷酸在细胞内的还原环境中从纳米偶联物表面释放，光照使得光敏剂产生单线态氧，破坏溶酶体膜的完整性。进而寡核巧酸从溶酶体中逃逸，到达细胞质和细施核，发挥调控基因的功能。接下来，我们将会引入治疗性寡核巧酸序列，比如Md-1和Bd-x来进行肿瘤的光动力和基因联合治疗，并希望将这一体系引入到动物实验层面。
总的来说，我们通过化学修饰或者共价偶联的方式来改进传统荧光分子，来提高溶解度，降低毒性等，获得了较好的结果，并且进一步地拓展了它们的应用范围。
参考文献（略）