第一章LAMP 技术的发展及其在水产养殖动物疾病诊断中的应用PCR技术
自1985年发明以来，在病原检测领域得到了广泛应用，但是人们一直未间断探索更为特异、敏感、快速、简便的方法。日本学者Notomi等于2000年发明了一种全新的核酸扩增技术——环介导恒温扩增 (loop-mediated isothermal amplification, LAMP)。该法在保持PCR技术优点的基础上，进一步增强了反应特异性，缩短了检测时间；特别是它不需要使用昂贵的热循环仪，在等温条件下就能完成反应，更便于推广应用。自报道以来LAMP技术受到越来越多的关注，目前相关报道已有180多篇。LAMP技术已经成为常规的核酸检测方法(NATs)(Mori et al., 2009)，多种人类病原微生物的LAMP检测试剂盒已经被开发。2004年，该技术首次用于鱼类致病菌迟钝爱德华氏菌的检测(Savan etal., 2004)。随后，LAMP技术在水产养殖病害领域的报道逐渐增多。本文就LAMP技术的发展历史及在水产养殖动物病原微生物快速检测中的应用做一综述。
1 LAMP技术的发展
LAMP技术是一种新型核酸扩增技术，由日本学者Notomi等发明。该技术针对靶基因的6个区域设计4条特异引物，分别为内引物FIP和BIP、外引物F3和B3(图1.1)，利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在恒温条件(60～65℃)催化新链合成，一个小时内将目的DNA从几个拷贝扩增到109～1010(Notomi et al., 2000)。LAMP扩增可以分为三步，即扩增反应起始、反应起始物形成和循环延伸。作为核酸扩增的经典方法，PCR目前已广泛应用于科学研究的众多领域，并成为分子生物学技术如分子克隆的常规方法。与其相比，LAMP技术检测时间更短，操作更为简便，又因为其反应中的Bst聚合酶较rTaq酶对抑制物不敏感，灵敏度更高。自2000年报道以来，LAMP技术在基本扩增机制、反应产物检测方法及其应用等方面都有了很大的发展，并已逐渐成为一种快速诊断工具。
2002年，Nagamine在LAMP反应中引入一对环引物(Loop-primers, LF和LB)，它能明显加快恒温扩增的速度，大大提高检测效率。环引物结合于LAMP扩增产物的F2和F1之间(或是B2和B1之间)，以F1到F2的方向或是B1到B2的方向杂交(图1.1)。它能结合的区域在已经与内引物杂交的情况下，不能再和环引物杂交，这样，所有的茎环DNA或者与内引物杂交，或者与环引物杂交，因此加快了扩增速度 (Nagamine et al., 2002)。目前，环引物也越来越多的用于实际的LAMP检测中。另外，反应体系中增加逆转录酶，还可以对靶RNA进行扩增，进而用于RNA病毒的检测(RT-LAMP)。LAMP引物的设计比常规PCR要复杂的多，这使许多科研工作者望而却步。Notomi对LAMP引物设计的原则做了详细的介绍(Notomi et al., 2000)，研究者可以作为参考人工设 计 引 物 。 目 前 已 有 专 门 的 LAMP 引 物 设 计 软 件 ， 如 PrimerExplorerV3用户只需提交目的片段序列，设置相关参数，系统便能给出多种引物组合供选择。最新版本的软件还可以考虑靶核酸序列的突变位点，设计对突变位点敏感或者不敏感的引物。
2 LAMP技术在水产养殖动物病原检测中的应用
核酸扩增是生命科学领域最具价值的工具之一，对水产病原微生物检测及临床医学上传染性疾病、基因紊乱和基因特性的诊断具有独特的应用价值。与其他核酸扩增方法相比，LAMP技术应用于病原体检测具有无法比拟的优势(表1.1)。LAMP法操作简单，仪器设备只需要一个水浴锅即可，总费用较低、耗时短，只要1 h左右即可完成扩增反应；反应产物可以直接通过肉眼观察，具有简单、快速、特异性强、扩增效率高等特点。LAMP技术发展初期主要应用于食源性微生物的检测。沙门氏菌(Salmonella)、军团菌(Legionella)、利斯特菌(Listeria)、产志贺毒素大肠杆菌(verotoxin-producing Escherichiacoli)和弯曲杆菌(Campylobacter)等微生物的LAMP检测试剂盒已经投入商业使用。目前，LAMP技术在核酸研究、疾病诊断、性别鉴定、转基因检测及病原检测等许多领域广泛应用。H5亚型禽流感病毒(H5 avian influenza virus, H5N1-HPAI)(Imai et al., 2006)、严重急性呼吸综合征冠状病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus, SARS)(Poonet al., 2005) 、 副 结 核 分 枝 杆 菌 (Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis,MAP)(Enosawa et al., 2003)等病原的LAMP快速检测方法已经成功建立。在水生动物病原微生物诊断领域，LAMP技术的报道也越来越多(如表1.2)，发展前景广阔。
2.1 细菌检测Savan 等
2004 年首次用 LAMP 法检测水产动物病原菌 —— 迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)。根据迟钝爱德华氏菌的溶血素(haemolysin)基因序列设计4条引物，成功地扩增了迟钝爱德华氏菌的溶血素基因，检测出从日本鳗鲡(Anguilla japonica)等4种水产动物和养殖水体中分离的5株迟钝爱德华氏菌，而检测非迟钝爱德华氏菌，都没有产生特异性扩增，从而证明LAMP法检测迟钝爱德华氏菌具有很强的特异性。将LAMP法和PCR方法的灵敏性进行比较，发现LAMP法对迟钝爱德华氏菌的最低检测极限为10CFU/ mL，比PCR法灵敏100倍。用LAMP法检测正常的和受迟钝爱德华氏菌感染的褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)，仅从受感染鱼的脾和肾中提取的DNA作为模板能产生特异性扩增，并且也检测了养殖水体中的迟钝爱德华氏菌，其最低的检测浓度为3.8×102CFU/mL。Itano等(2005)用LAMP法检测诺卡氏菌(Nocardia seriolae)病，最低检测极限为103CFU/ mL，比PCR法灵敏10倍。而且当从被感染鱼的脾中提取DNA作为反应模板，LAMP法 更 远 优 于 PCR 法 。 Yeh 等 采 用 LAMP 法 快 速 检 测 柱 状 黄 杆 菌 (Flavobacteriumcolumnare)(Yeh et al., 2005b)，通过16S rRNA基因序列设计2对引物，60℃反应60min，产物通过琼脂糖电泳检测。检测了17株菌，结果只有5株柱状黄杆菌产生扩增。从人工浸泡感染的斑点叉尾鮰的皮肤、鳃、头肾中提取DNA作为LAMP法的模板都产生了特异性的扩增，而正常鱼中都没有产生扩增反应。
第三章快速检测鳗弧菌方法的建立........................................ 40-50
1 前言........................................ 40-41
2 材料与方法........................................ 41-44
2.1 菌株........................................ 41
2.2 细菌基因组DNA 抽提........................................ 41
2.3 引物设计与合成........................................ 41-42
2.4 LAMP 扩增条件的确立........................................ 42-43
2.5 LFD 检测 ........................................ 43
2.6灵敏度验证 ........................................ 43-44
2.7 LAMP-LFD 的特异性验证........................................ 44
2.8 侵染实验 ........................................ 44
第四章脾肾坏死病毒LAMP 检测方法........................................ 50-63
第一节脾肾坏死病毒聚合酶的克隆........................................ 50-56
1 前言 ........................................ 50
2 材料与方法........................................ 50-51
2.1 材料 ........................................ 50-51
2.2 引物设计与ISKNV DPOL的克隆........................................ 51
2.3 序列特征和生物信息学分析........................................ 51
3 结果 ........................................ 51-54
第五章快速检测对虾白斑综合症方法的建立........................................ 63-69
1 引言 ........................................ 63
2 材料与方法........................................ 63-65
2.1 材料 ........................................ 63-64
2.2 重组质粒的构建........................................ 64
2.3 引物设计与合成........................................ 64-65
2.4 LAMP 扩增反应........................................ 65
2.5 PCR 扩增反应 ........................................ 65
2.6 LAMP 扩增结果目视观测........................................ 65
结论
(1)克隆得到了溶藻弧菌 OmpK 基因和 ISKNV 的 DNA 聚合酶基因，其长度分别为809bp 和 2847bp。序列分析表明，外膜蛋白 OmpK 基因在溶藻弧菌种内可能存在一定的保守性，与同属其他弧菌序列同源性较高，每一种弧菌 OmpK 基因都有一段特异性序列，可用于设计核酸探针或特异性引物来诊断、检测溶藻弧菌等海水鱼致病性弧菌。虹彩病毒的 DPOL 基因属内同源性很高，而属间差异很大。
(2)构建了溶藻弧菌 pET-28a-OmpK 原核表达载体，并在大肠杆菌中高效表达，通过免疫小鼠制备了抗血清，建立了溶藻弧菌的 ELISA 检测法。
(3) 根据溶藻弧菌OmpK基因序列，设计4条LAMP引物，通过条件优化，建立了溶藻弧菌的LAMP检测法，其检测下限比PCR法低一个数量级，相当于38 CFU/ mL。此方法在国内外尚未见相关报道。
(4) 根据鳗弧菌的金属蛋白酶empA基因序列设计3对LAMP引物及FITC标记的探针，确定其LAMP扩增最适条件，建立了针对鳗弧菌的LAMP-LFD检测法。应用LAMP-LFD法检测时间大约30min，检测灵敏度为7.7 CFU/ mL，而且能从细菌侵染的香鱼肾、肝、脾、肌肉等组织中特异性检测鳗弧菌。该技术应用于鳗弧菌检测尚属首次。
(5) 根据ISKNV的DPOL基因序列设计LAMP引物及探针，成功建立了ISKNV的LAMP-LFD检测法。其检测极限大约10 个拷贝，灵敏度分别是LAMP-AGE和PCR-AGE灵敏度的10倍和1000倍。
(6) 根据WSSV的结构蛋白VP26基因设计引物，建立WSSV的LAMP检测法，其确定的扩增条件为65℃反应60 min，检测灵敏度比常规PCR法高一个数量级，扩增结果借助SYBR Green I 荧光染料进行肉眼观察，实现了检测的一步完成。