第一篇 文献综述
第 1 章 奶牛乳腺炎的研究现状
1.1 奶牛乳腺炎的发病原因
奶牛乳腺炎症状为乳腺实质、间质的炎症，这主要是由机械刺激、病原微生物浸入以及化学或物理性损伤所致，导致乳汁中体细胞含量增加，乳腺组织发生病理变化，是奶牛养殖业的常发病之一。
奶牛乳腺炎病因较多，而且该疾病的症状也会在不同地区发生变化，具体原因如下。
1.1.1 病原体感染
病原体感染为奶牛乳腺炎高发的重要诱因，微生物中的细菌、真菌、病毒和支原体等都是此病的主要病原体。根据病原体的来源和传播方式，病原体通常分为传染性微生物和环境性微生物两大类。传染性微生物（停乳链球菌、金黄色葡萄球菌、霉形体等）通过挤奶工人和挤奶器的传播途径侵害奶牛乳腺使其患病。环境性微生物通常寄生在牛体表皮肤和奶牛生活环境中，虽然不会直接侵害奶牛乳腺组织，但当奶牛的乳头和乳房被病原体污染时或受到创伤时，这些微生物就会进入乳头池继而引起乳腺感染，如链球菌、 大肠杆菌、 绿脓杆菌等[12]。其中大肠杆菌和金黄色葡萄球菌等是此病最常见的病原体，但各地因为地理环境的不同、饲养方式的改变、卫生条件的差异，导致各地方病原感染情况不尽相同。
1.1.2 饲养管理因素
奶牛场的饲养管理对奶牛乳腺炎的发生也有很大的关系。为了提高产奶量，奶牛场常常会饲喂高能量、高蛋白日粮，从而导致在产奶量增加的同时，相对的增加了乳房负担，降低了奶牛的抵抗力，容易诱发乳腺炎[13]。严格的牛群科学管理，要求牛场应及时分离已到干乳期的奶牛，并及时淘汰久治不愈患慢性乳腺炎的病牛，排除引发乳腺炎的病因。应对牛舍、挤奶处、挤奶机器严格消毒，对挤奶工人严格培训，以及对奶牛定期体检，对患病奶牛及时隔离、治疗，都可以减小乳腺炎的患病几率。此外，在感染其他病害期间，可能会并发乳腺炎，应事先观察奶牛并做好预防疾病的准备。
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1.2 奶牛乳房炎的诊断
乳腺炎根据不同程度的症状表现被划分为不同类型的乳腺炎。乳房炎的国际诊断标准为：如果每毫升乳汁中含有 50 万以下的体细胞，就可判为阴性；如果每毫升乳汁中含有 50 万以上的体细胞，就可判为阳性。不同的症状表现与国际诊断标准相配合，可以诊断出不同类型的乳腺炎。
1.2.1 临床型乳腺炎
临床型乳腺炎的发病概率约为 3% ~ 5%，根据病情的严重程度，也可将其分为轻度、重度以及急性全身性乳腺炎。轻度临床型乳腺炎，乳腺组织仅有轻微的病理变化和临床症状[14]。一般表现为：触诊时伴有轻微疼痛，肿胀以及发热。乳汁中体细胞数量升高、PH 值上升，并伴有凝乳块和絮状物。此时根据国际标准，如果每毫升乳汁中含有 50 万以下的体细胞，就可判为阴性；如果每毫升乳汁中含有 50 万以上的体细胞，就可判为阳性。此时 PH 值接近于血液 PH 值 7.4。重度临床型乳腺炎，此类乳腺炎乳腺组织出现了明显的病理变化。一般表现为乳房肿胀，皮肤变红，乳房明显发热，乳腺出现硬块，病牛在触诊时表现疼痛，同时产奶量大幅度减少，乳汁出现大量乳凝块。急性乳腺炎，此时乳腺组织被严重的损害，乳房乳头肿胀明显，乳头发红。触诊时，奶牛疼痛难忍，乳房明显发热，乳房坚硬，丧失以往的柔软特性，同时仅能挤出少量乳汁。病牛伴随着体温持续升高，心率增快，萎靡不振，采食量下降。如果不及时治疗患病牛，病牛死亡几率很高，从而造成经济损失。
1.2.2 隐性乳腺炎
隐性乳腺炎的诊断较临床型乳腺炎复杂得多，因为隐性乳腺炎没有明显的临床症状，乳房也与健康的奶牛没有太大区别，用肉眼很难观察到这种变化，但是如果仔细检查（对乳房进行触检）可在乳腺中触摸至硬结节,并且乳汁中含有絮片状凝乳，同时其乳汁的 PH 值（此时 PH 值接近于血液 PH 值 7.4）、体细胞数、的含量会升高[14]。这种类型的乳腺炎诊断方式常为乳汁病原微生物检查、乳汁体细胞计数。
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第 2 章 中草药在动物疾病治疗的研究进展
2.1 中草药活性成分
中草药有多种天然活性物质和药用活性成分。例如：多糖、甙类、类黄酮类、酯类、酚类、有机酸、等多种物质。大黄是临床常用中药，药用历史悠久，大黄酸是大黄的主要有效成分。陈海以乳腺癌肿瘤细胞（SK-Br-3）为体外模型，探究大黄酸对肿瘤细胞中 HER-2 表达的影响，结果表明大黄酸可以降低人乳腺癌细胞中 HER-2 蛋白及 mRNA 的高表达，同时抑制了人乳腺癌细胞的增殖[22]。石航的研究表明，黄芪甲苷是黄芪中一种重要的活性成分[23]。李娜以家兔为模型，探究黄芪甲苷对家兔子宫内膜炎模型的治疗效果，用不同浓度的黄芪甲苷处理以菌液诱导的家兔子宫内膜炎模型，并运用病理组织学方法观查子宫内膜，运用Western blot 检测子宫内膜组织中的 CD40 蛋白表达情况。结果发现随着黄芪甲苷作用浓度的增高，子宫内膜组织中的炎症细胞及浸润范围减少；子宫内膜炎模型子宫内膜组织中的 CD40 的蛋白表达。这证明了黄芪甲苷对子宫内膜炎有一定的改善作用黄芪甲苷对家兔子宫内膜炎模型治疗效果的评估[24]。为了继续探究黄芪甲苷改善炎症疾病的内部机制，罗先荣以构建的大鼠系膜增生性肾小球肾炎模型为研究对象，用不同剂量黄芪甲苷处理模型。通过 ELISA 检测法、切片染色观察法、Western blot 等方法探究模型变化情况。结果得出肾小球病理状况一定程度缓解，细胞凋亡率降低、TLR4、NF-κB 蛋白表达降低、MMP-9 蛋白阳性表达率升高、TIMP-1 蛋白阳性表达率降低( P＜0.05) [25]。这证明黄芪甲苷通过抑制TLR4 /NF-κB 信号通路，影响 MMP-9、TIMP-1 蛋白表达进而发挥对系膜增生性肾小球肾炎大鼠的保护作用。这为黄芪甲苷缓解机体炎症的机制研究提供了思路。黄欣欣以 SD 小鼠为实验动物，建立了小鼠高脂血症模型，探究了大果山楂中黄酮类成分对高血脂症小鼠总抗氧化能力和抗氧化酶活性的影响。
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2.2 中草药的作用
2.2.1 抑菌/抗病毒作用
抗生素一直以来被全世界广泛使用，但是随着越来越多的人滥用抗生素，导致很多细菌都产生了耐药性，并且在动物身上和畜产品有残留，从而对人类的食品安全造成威胁[3]。近年来不少科学家和研究人员开始对中草药越来越感兴趣，纯天然无污染无残留的特点不容易使细菌产生耐药性，中草药的抗菌机制是研究重点和热点。
中草药的临床研究发现，尽管不同中草药的体外抗菌范围和程度有一定差距，不同中草药的有效成分也有所不同，但一般来说，大部分的中草药在临床研究中均表现出显著且广谱的抗菌作用。冯平选取金银花、鱼腥草、黄连、连翘、蒲公英五种药物分别处理奶牛乳腺炎病原菌溶酪葡萄球菌和乳房葡萄球菌，得到了这两种病原菌对这五种中草药均有不同程度的敏感[28]。梁引库通过乙醇提取法提取了蒲公英叶中的绿原酸，后将其通过吸附柱（大孔树脂 DA-201），进行分离纯化。运用绿原酸进行抑菌试验，发现蒲公英绿原酸对大肠杆菌、枯草杆菌、青霉均有良好的抑制作用[29]。陈娜的实验结果也证明了蒲公英绿原酸的抑菌作用[30]。王明英通过回流浸提法提取杜仲叶乙醇提取液后，采用微量法测定杜仲对大肠杆菌和沙门氏菌的最低抑菌浓度（MIC），发现杜仲叶提取物对这两种细菌具有一定的抑菌作用[31]。袁婷提取了四种不同浓度的千里光乙醇溶液，将不同浓度的千里光乙醇溶液溶于生理盐水处理肺炎链球菌，结果发现发现千里光 70%乙醇提取物的抑菌效果极好[32]。邓文喻通过水煎法提取了黄岑和鱼腥草两种中药水煎液，采用微量稀释法测定两种中药水煎液对 30 株肺炎克雷伯均的最低抑菌浓度（MIC），并通过 MTT 法建立肺炎克雷伯菌被膜生成标准曲线。结果发现黄岑与鱼腥草水煎液对肺炎克雷伯菌的生物被膜具有抑制作用[33]。中草药不仅对细菌和真菌有抑制作用，还具有抗病毒的作用。高博通过使用大青叶水溶性提取物处理白纹伊蚊C6/36 细胞和登革病毒Ⅱ型，并通过 MTT 法和实时荧光 RT-PCR 法相结合来研究药物对病毒的抑制作用。结果发现大青叶水溶液提取物对细胞毒性较小，且对病毒的增殖有着明显的抑制作用，并且抑制作用与浓度呈正相关。同时发现大青叶对病毒增殖的抑制作用是由于病毒在细胞内的复制增殖过程被抑制而导致的[34]。这一研究为探究中草药抗病毒的机制提供了新的思路。黄筱钧制备甘草醇提取液后处理 Hep-2 细胞和呼吸道合胞病毒（RSV），结果发现甘草对细胞的毒性小于比利巴韦林，且能在体外抑制 RSV 的增殖，以及直接杀伤 RSV[35]。黄远总结了近年来对板蓝根的研究，系统的展示了板蓝根中多种成分抗流感病毒的特性，发现板蓝根抗流感不仅仅直接抗病毒，更显著的抑制病毒诱导的炎症应答[36]。这为以后中草药对病毒的抑制作用的研究提供了新的思路。
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第 3 章 中草药添加剂对奶牛乳中乳脂和乳蛋白的影响 ............... 24
3.1 材料与方法 ........................... 24
3.1.1 材料 .......................... 24
3.1.2 试验方法 .......................... 24
第 4 章 中草药添加剂对奶牛血清炎性指标和炎性因子的影响 ... 28
4.1 材料与方法 ........................... 28
4.1.1 材料 ................................ 28
4.1.2 试验方法 .................... 28
第 4 章 中草药添加剂对奶牛血清炎性指标和炎性因子的影响
4.1 材料与方法
4.1.1 材料
4.1.1.1 主要试剂
蒲公英等，详细材料请参考本篇第 1 章 1.1.1；SAA 测试盒( 批号为 ml042466)、白细胞介素 1（IL-1β）测试盒( 批号为 ml064295)，白细胞介素 2（IL-2）测试盒( 批号为 ml023901)，白细胞介素 8（IL-8）测试盒( 批号为 ml023909) 均购自上海酶联生物科技有限公司。
4.1.1.2 主要仪器
本研究用到的主要仪器有：低温离心机（Thermo，美国）、普通离心机（Thermo，美国）、-80℃超低温冰箱（Thermo，美国）、-20℃低温冰箱（中国海尔公司）、4℃冰箱（中国海尔公司）、酶标仪（BioTek，美国）、移液枪（Eppendorf，德国）、离心管。
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结论
以蒲公英、王不留行、黄芪、鱼腥草组成的复方中草药添加剂能够预防和治疗奶牛隐性乳腺炎。其一方面能够显著降低乳腺炎奶牛乳中体细胞数至正常水平及显著降低乳腺炎奶牛血清中的 SAA，IL-1β、IL-2、IL-8 的含量、降低预防组正常奶牛血清中的 IL-2 的含量。这一结果对预防和治疗奶牛乳腺炎有着重要的意义。
参考文献（略）