第一章 引言
1.1 兰科植物繁育系统研究概况
植物的繁育系统是其种群能否长久延续的一个重要体系，通常是指对直接影响后代遗传组成的所有有性特征进行研究[8]。交配系统是植物繁育系统研究的核心[9]，其直接控制居群内个体变异的发生、居群内及居群间变异的分布频率等植物多样性成因，能直接影响后代的遗传组成[10-11]，人工授粉和花结构理论的创立是其研究的基本方法[12]。这是人类了解大自然生存规律的基础，也是人类保护自然资源的方式之一，对于研究濒危物种保育生物学具有重要意义。
兰科植物作为被子植物中一个十分进化的类群，其花的结构与昆虫传粉高度适应，据研究[13-14]统计约 60%的种类，仅有一种特定的传粉者[15-16]，但传粉者类型多样，其中以蜂类和蝇类最为常见[17]，但也有见鸟类、蟋蟀等动物[18-19]。AngelVale 等[20]对位于古巴西部的 Tolumnia guibertuaba 采用传统的繁育系统研究方法研究，通过人工授粉试验证明植株体为自交不亲和个体。通过野外观察、杂交指数计算及人工控制授粉试验等方法对大序隔距兰（Cleiaostoma paniculatum）的繁育系统进行研究，得出大序隔距兰的繁育系统以异交为主，部分自交亲和，需要传粉者的结论[10]。王武[21]通过野外观察和授粉试验发现泽泻虾脊兰存在被动自交现象，是高度自交亲和的繁育系统，不存在自动的自花授粉与无融合生殖，需要传粉者。兰科植物繁育系统的研究结果显示，大部分兰属植物的繁育系统是混合交配系统，需要传粉者，不存在自动自花授粉和无融合生殖，但也有少数种类存在自动自花授粉，如大根兰（Cymbidium macrorhizon）和兔耳兰（C.lancifolium）[22]。花粉作为被子植物雄配子体或雄配子细胞的载体，其质量和生活力是完成有效受精的必要条件，是植物繁育系统中决定交配成功与否的重要因素[23-24]。此外，在研究植物交配系统工作中，花粉生活力测定与贮藏性的研究是解决亲本在时间与空间上的隔离进而扩大交配范围的前提，并且花粉贮藏也是保存珍稀植物种质资源一个重要途径[25-26]。为了更好地夯实兰科植物生殖、繁衍及种质资源保育工作的理论基础，目前国内外已有大量研究学者对兰科植物的繁育系统进行研究。
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传统的兰花繁殖栽培方法主要靠分株繁殖，繁殖速度缓慢，不利于产业发展。兰科植物虽可采用种子繁殖，但由于兰花种子细小，需与适宜的菌根真菌共生才能萌发，常规播种难以萌发，而通过组培快繁技术，建立高效、稳定的兰科植物快繁体系，可以很有效地改变现状，实现工厂化生产，同时对兰科植物种质资源的离体保存提供有效保障。兰科植物的组培快繁技术体系始于 20 世纪 60 年代，Morel[42]以大花惠兰的茎尖为外植体材料成功诱导出原球茎并形成再生植株，为兰花工厂化生产奠定了基础。我国兰花组织培养技术起步较国外晚，组培材料以附生兰为主，到 20 世纪后期，国内陆续加大关于地生兰组培技术及快繁体系构建方面的研究力度，先后建立起几十个品种的离体快繁技术体系，并将其推广到兰花实际生产应用中[43]。
1.2.1 外植体的选择
兰花组培快繁的取材来源较多，兰花的根、茎、叶、花器官（包括花粉、花梗和花梗腋芽等）、种子等具有再生能力的部位都可作为外植体用于组培快繁、诱导并获得再生植株，不同材料、不同阶段对培养基和激素等的要求均有所不同。
早前，植物学家认为以根为外植体进行兰花组培快繁成功转化为芽体的可能性极低[42]，但此后，以根为外植体的快繁技术也进行了一些研究，如曾宋君等[44]以蝴蝶兰（Phalaenopsis aphrodite）的根段尝试快繁培养，认为 1/2 MS、MS、Knudson C、VW 均有较好的诱导效果，但 MS 培养基的效果最佳，激素则以浓度 5.0 mg.L-1 的 6-BA 和 0.5 mg.L-1 的 2,4-D 有较好的促进效果。徐宏英等[45]成功地以大花蕙兰幼根为外植体材料进行组织培养，并以此探讨大花惠兰快繁的影响因子。此外，在墨兰的快繁中曾宋君等[46]也以其根作为外植体进行过相关试验研究，但未能成功诱导出原球茎。因此，根的诱导在兰花组培快繁中虽有成功的案例，但相较于其他外植体材料来说，诱导难度较大。
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第二章 竹叶兰花部结构与繁育系统研究
2.1 材料与方法
2.1.1 试验材料
以栽植于福州市于山风景区兰花圃的竹叶兰为试验材料。（试验所用药品皆购买于福州市伯乐林生物科技有限公司，下同。）
2.1.2 试验地概况
试验地位于福州市于山风景区兰花圃内。福州市气候类型是拥有丰富气候资源的亚热带海洋性季风气候，全年气温平均 16～20 ℃，1-2 月最冷，平均 6～10 ℃，7～8 月最热，平均 24～29 ℃，年相对湿度和年平均降水量都较高，分别为 77%和 900～2100 mm，年平均日照 1700～1980 h，无霜期高达 326 d。于山风景区位于福州市鼓楼区五一广场附近，临近乌山、屏山，海拔约 50 m。于山兰花圃是福建省著名兰花圃之一，拥有丰富的兰花资源和良好的生态环境，占地面积广阔，圃内植被丰富，湿润的林荫环境十分适合兰花生长。
2.1.3 花期与花部形态观测
于 2018 年至 2019 年，对试验地的竹叶兰进行花期观测，详细记录其开花特性。具体观察方法为，在开花前对观察植株所有的花芽进行标记，在开花期每天对其进行检查，记录每个花序上花朵的开放和枯萎日期。花开放的判断标准是中萼片开始扬起，唇瓣初现，传粉者可以有效访花；花枯萎的判断标准是花被片开始变色、或形态开始改变、或唇瓣开始枯萎，失去有效传粉功能[120-121]。
在竹叶兰盛花期，随机选取来自不同植株上完全开放的花 40 朵，测量其花部形态参数。测量工具为游标卡尺（精度 0.02 mm）。测量指标包括花冠直径、萼片长宽、花瓣长宽、唇瓣长宽、蕊柱长宽（不包含花药）等。
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2.2 结果与分析
2.2.1 试验地竹叶兰开花物候和花部形态特征
2.2.1.1 开花物候
通过观察记录，试验地竹叶兰群体开花情况分两个部分，当年的 5～12 月以及翌年 1-3 月均有花朵开放，其中 8～10 月为盛花期，单花花期 3.42±0.83 d。如图 2-1 所示，竹叶兰的花芽由枝条顶部抽出，从现蕾至开花整个过程约 8 d。
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第三章 竹叶兰种子无菌萌发与植株再生研究.........................................26
3.1 材料与方法...............................26
3.1.1 试验材料............................26
3.1.2 试验方法...........................26
第四章 竹叶兰不定芽诱导技术研究..................................40
4.1 材料与方法...............................40
4.1.1 试验材料................................40
4.1.2 试验方法.........................40
第五章 竹叶兰多倍体诱导试验................................47
5.1 材料与方法................................47
5.1.1 试验材料...........................................47
5.1.2 浸泡法.................................47
第五章 竹叶兰多倍体诱导试验
5.1 材料与方法
5.1.1 试验材料
以无菌播种45 d的竹叶兰原球茎为材料，参照卓孝康[119]大苞鞘石斛的研究方法，采用浸泡法和混培法进行多倍体诱导初探。
在无菌条件下，取无菌播种 45 d 的竹叶兰原球茎，分别转入秋水仙素浓度梯度为 0.00%、0.01%、0.03%、0.05%和 0.10%的 1/2 MS 固体培养基中避光培养30 d，之后再转移至不含秋水仙素的固体培养基（1/2 MS+活性炭 1 g.L-1+蔗糖 30g.L-1+琼脂 7 g.L-1+6-BA 1.5 mg.L-1+NAA 0.5 mg.L-1）中光培养（表 5-2）。每瓶接10 个原球茎，4 瓶为一个重复，共 3 个重复。培养的温度、光照条件同 3.2.2.1。定期观察记录生长状况，30 天继代一次，每次继代统计死亡个体，继代两次后转入花宝 1 号 1 g.L-1+花宝 2 号 1 g.L-1+蛋白胨 2 g.L-1+NAA 0.5 mg.L-1+6-BA 0.2mg.L-1+琼脂 7 g.L-1+蔗糖 15 g.L-1+活性炭 2 g.L-1 进行生根培养。
参照卓孝康[119]的方法，观测竹叶兰多倍体处理植株的株高、叶片等植株形态学特征后，初步筛选出多倍体变异植株和正常植株，并分别测定变异植株和正常植株的形态学指标。
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六章 结论与展望
6.1 结论
本文以竹叶兰为材料，对其花部结构与繁育系统、种子无菌萌发与植株再生及不定芽诱导等方面进行详细研究，探讨了竹叶兰的繁育机制，筛选了竹叶兰种子萌发与植株再生的最佳条件，以及对当年生茎尖和茎段外植体不定芽诱导进行了初步尝试，建立较为完整的竹叶兰快速繁殖体系。同时，对竹叶兰原球茎进行了多倍体诱导试验，初步筛选出了竹叶兰原球茎的多倍体诱导条件。主要研究结果如下：
（1）竹叶兰在试验地的盛花期在 8～10 月，单花花期 3.42±0.83 d，单花开放时间内竹叶兰花粉活力和柱头可授性逐渐下降。竹叶兰人工自花授粉、人工异花授粉的结实率分别为 89.47%和 79.49%，自然条件下的结实率为 18%，自交高度亲和，不存在自动的自花授粉和无融合生殖，存在传粉媒介。不同授粉方式产生的果实形态在授粉后 30 d 和 60 d 时有明显差异，且授粉后不同时期的种子生活力差异较大，
TTC 法和萌发法检测结果均以授粉后 60 d 的种子生活力最高。
（2）本试验中，竹叶兰种子无菌萌发的最适培养基为 1/2 MS ＋琼脂 7 g.L-1＋蔗糖 30.0 g.L-1 ＋活性炭 1 g.L-1＋椰子乳 100 mL.L-1＋NAA 1.0 mg.L-1＋6-BA2.0 mg.L-1＋花宝 1 号 0.5 g.L-1，萌发率达 83.79%；在基本培养基中添加椰子乳50 mL.L-1＋NAA (0.5～1.0) mg.L-1＋6-BA (2.0～2.5) mg.L-1＋花宝 1 号 (1～1.5)g.L-1 有利于原球茎膨大和叶芽分化；0.2 mg.L-1 IBA 和 2 mg.L-1 6-BA 对竹叶兰种胚苗芽的生根培养有极显著影响；炼苗移栽的最适培养基质以珍珠岩：泥炭土=1:1 为宜，成活率高达 98%，移栽效果良好。
（3）对竹叶兰不定芽诱导外植体进行表面消毒试验，茎尖和上部茎段分别以 2%和 10%的次氯酸钠浸泡 12～15 min 消毒效果较好。相对来说，竹叶兰不定芽诱导率和增殖系数，茎尖比上部茎段的诱导和增殖效果更好。
（4）对竹叶兰进行多倍体诱导试验，不同处理的植株死亡率呈现出随秋水仙素浓度升高和处理时间延长而增高的变化趋势。秋水仙素对植株继代培养有毒害作用，混培法比浸泡法毒害影响持续时间更长，相对来说，采用浸泡法以 0.10%秋水仙素浸泡 12 h 的诱变率最高，为 23.33%（n=60）。经比较鉴定，竹叶兰多倍体变异植株与二倍体正常植株存在较明显的形态学、细胞学及染色体差异。
参考文献（略）