引言
银黄清肺胶囊是安邦制药有限公司具有知识产权的独家品种，处方由北葶苈子、麻黄、苦杏仁、浙贝母、枇杷叶、大青叶、银杏叶等14味中药组成，具有清肺化痰、止咳平喘之功效，主要用于治疗慢性支气管炎急性发作之痰热壅肺证。该制剂具有量小、疗程短的特点，且为中药小胶囊（0.15g/粒），方便有吞咽困难（儿童/体虚老人）吞服。现代药理研究表明该制剂对免疫系统有一定的调节作用，具有止咳、祛痰、平喘、抗炎、抑菌、镇痛等多项药理作用。
本论文通过银黄清肺胶囊体外复方制剂指纹图谱以及健康大鼠体内含药血清指纹图谱的比较研究，初步确定含药血清图谱检测到21种成分中6个峰为血清固有成分，8个峰为制剂原型成分，7个峰为代谢产物；并采用HPLC-Q-TOF-MS/MS技术对银黄清肺胶囊的主要药效物质和化学成分进行了探索，为进一步较全面的研究和分析银黄清肺胶囊的药效物质基础提供试验依据。
本研究隶属于湖南省科技厅科技计划专项（2014XK4008)，湖南省战略新兴产业项目科技攻关类项目（2014GK1022)及长沙市生物与新医药产业科技支撑重大专项项目：中药创新关键技术研究及产业化（K1204035-31)。主要在于通过HPLC、HPLC-MS等检测技术对银黄清肺胶囊的化学组成和药效物质基础进行研究，对于阐明银黄清肺胶囊的药效物质基础和作用机制，提高制剂质量具有重要意义。
第一部分银黄清肺胶囊HPLC指纹图谱研究
银黄清肺胶囊处方由北葶房子、麻黄、苦杏仁、浙贝母、枇杷叶、大青叶、银杏叶等14味中药组成，具有清肺化痰、止咳平喘之功效，主要用于治疗慢性支气管炎急性发作之痰热壅肺证。在临床上，作为治疗支气管炎急性发作的药物，具有较好的疗效。
目前银黄清肺胶囊的企业质量控制方法为国家食品药品监督管理局标准WS3-889 (Z-174) -2009Z。标准中仅采用TLC法对成品中北葶房子、浙贝母，五味子、穿山龙、积实等药材进行定性鉴别，采用HPLC法对方中麻黄碱进行定量测定。但银黄清肺胶囊成分复杂，由14味药物组成，仅以几种有效成分无法全面表征中药制剂的物质基础和化学成分群的整体性、复杂性，难以全面控制银黄清肺胶囊的内在质量。指纹图谱是顺应中药多组分、多IE点的整体作用的特点，从“全成分”角度出发的一种现代化中药质量控制方法，对非单一成分药物的质量控制更加全面[5-6]。本研究采用HPLC法对银黄清肺胶囊的HPLC指纹图谱进行了研究，对主要特征峰进行了化学指认，对各色谱峰所代表的化学成分进行了初步归属，通过运用相似度评价、聚类分析等识别技术，为制定全面而整体的银黄清肺胶囊质量控制方法提供实验依据。
1.1仪器与材料
岛津LC-10AT高效液相色谱仪（包括LC-10AT录、SIL-10AD进样器、SPD-M10A检测器、CTO-10AS柱温箱、CLASS-VP 5.0色谱工作站，日本岛津公司）。AL204电子天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；KQ5200DE型数控超声仪（昆山市超声仪器有限公司）。
乙腈为色谱纯，甲醇、憐酸均为分析纯，水为哇哈哈纯净水。各对照品分别为盐酸麻黄碱（批号171241-201007，质量分数>98%)、苦杏仁苷（批号110820-201004，质量分数>98%)、澄皮苷（批号110721-201115，质量分数》98%)、声丁(批号 100080-200707，质量分数 >98%)、柚皮昔(批号 110722-201312，质量分数>98%)、靛玉红（批号110717-200204,质量分数>98%)、槲皮素(批号100081-201408,质量分数>98%)、齐缴果酸（批号110709-201206，质量分数》98%)、五味子醇甲（批号110857-201412,质量分数>98%)、甘草苷（批号111610-201106，质量分数>98%)、五味子甲素（批号110764-201312,质量分数>98%)、贝母素甲（批号110750-201110，质量分数>98%)、贝母素乙（批号110751-201110,质量分数>98%)均购自中国食品药品检定研究院；橙皮素（批号，13061701,质量分数>98%)购自成都曼斯特生物公司。北萃房子、麻黄、苦杏仁、银杏叶、浙贝母、枇把叶、大青叶、五味子、枳实、甘草、穿山龙、一枝萬、石菖蒲、生石膏等14味药材均由湖南安邦制药有限公司提供，由湖南省中医药研究院张水寒研究员鉴定，分别为十字花科植物独行菜Lepidiumapetalum WiUd.的成熟种子、麻黄科植物草麻黄Ephedra sinica Stapf.的干燥草质莲、蔷薇科植物山杏Prunus armeniaca L.var.ansu Maxim.的干燥成熟种子、银杏科植物银杏Ginkgo biloba L.的干燥叶、百合科植物浙贝母Fritillaria thunbergiiMiq.的干燥麟莲、蔷蔽科植物枇杷Eriobotrya japonica (Thunb.) Lindl.的干燥叶、十字花科植物孩蓝Isatis indigotica Fort.的干燥叶、木兰科植物五味子Schisandrachinensis (Turcz.) Baill.的干燥成熟果实、芸香科植物酸澄Citrus aurantium L.的干燥幼果、豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥根和根荃、薯薪科植物穿龙薯蓣Diosocorea nipponica Makino的干燥根莲、菊科植物一枝萬Artemisiarapetris L.的干燥全草、天南星科植物石富蒲Acorus tatarinowii Schott的干燥根基、硫酸盐类矿物石膏gypsum fibrosum。10批银黄清肺胶囊成品（批号S1:130301、 S2： 130401、 S3； 140103、 S4： 130503、 S5: 130101、 S6： 130103、S7； 140101、S8； 130501、S9： 130303、S10： 130403)均由湖南安邦制药有限公司提供。
1.2方法与结果
1.2.1色谱条件
色谱柱为 InertilClS (250 mm X 4.6 mm，Sum) % 检测波长 210 nm;柱温30。C;体积流量l.OmL/min;进样量10 uL；流动相为乙腈-0.1%憐酸水溶液，梯度洗脱：0~5 min, 2~5%乙腈；5—0 min, 5~10%乙腈；10~30 min, 10~20%乙腈；30~50 inin,20~30%乙腈；50~60 min, 30~50%乙腈；60~80 min，50~80%乙腈；80~85 min, 80~85%乙腈；85~90 min, 85~95%乙腈；90?115 min, 95%乙腈；115~120 min, 95~2%乙腈。
1.2.2溶液制备
1.2.2.1对照品溶液分别取盐酸麻黄碱、五味子醇甲、苦杏仁苦、橙皮苷、橙皮素、靛玉红、槲皮素、齐墩果酸、贝母素甲、贝母素乙、五味子甲素、甘草苦、戸丁、柚皮苷对照品适量，用甲醇分别制成质量浓度分别为0.2 mg/mL. 6 mg/mL、0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.2 mg/mL、0.1 mg/mL、0.01 mg/mL、0.08 mg/mL、0.35mg/mL、0.27 mg/mL、0.18 mg/mL、0.2 mg/mL、0.2 mg/mL、0.25 mg/mL 的各对照品溶液。
1.2.2.2银黄清肺胶囊供试品溶液取本品内容物，混勾，研细，取约1.2 g，精密称定，置烧瓶中，精密加入甲醇30 mL,称定质量，超声0.5 h,取下，放至室温，用甲醇补足减失质量，滤过，摇勾，经0.45 um的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
1.2.2.3各药材供试品溶液取各药材分别粉碎成粗粉，取北葶房子0.48 g、麻黄0.3g、苦杏仁0.36 g、浙贝母0.36 g、枇杷叶0.36 g、大青叶0.24 g、石菖蒲0.36 g、穿山龙0.36 g、一枝嵩0.24 g、银杏叶0.36 g、五味子0.12 g、枳实0.12 g、甘草0.12 g，分别精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇30 mL，称定质量，超声提取0.5h，放冷，用甲醇补足减失质量，摇勾，将提取液滤过，取续滤液，用0.45 um微孔滤膜滤过，取续滤液，作为药材溶液。
1.2.3方法学考察
1.2.3.1精密度试验取批号为130301的银黄清肺胶囊样品1份，按“1.2.2.2”项下方法制备供试品溶液，精密量取同一供试品溶液，连续进样6次，考察色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性。21号峰五味子醇甲峰形好，分离度较好，含量较高且稳定，故选为参照峰，计算得其中28个色谱峰相对保留时间的RSD均小于1.5%，相对峰面积RSD均小于2.0%。说明仪器精密度良好。
第三部分银黄清肺胶囊含药血清指纹图谱研究.............30
3.1 材料与仪器..........................30
3.1.1 实验动物..........................30
3.1.2药物与试剂..........................30
3.1.3 仪器..........................30
3.2 方法与结果..........................31
第四部分总结与展望..........................39
4.1总结..........................39
4.2取得的主要成果.............39
4.3展望..........................40
第三部分银黄清肺胶囊含药血清指纹图谱研究
银黄清肺胶囊是由浙贝母、穿山龙、大青叶、生石膏、苦杏仁、麻黄、北葶房子等组成，其功能主治为清肺化痰，止咳平喘。临川用于治疗咳嗽略痰，痰黄而粘，胸闷气喘，眼干口渴，便干尿黄等疯热壅肺证。众所周知，中药含有许多复杂旳成分，只有那些被人体吸收进入血液的药物成分及其代谢的产物（血中移行成分）才能对人体产生药效[27]。本研究釆用HPLC法建立了银黄清肺胶囊的含药血清指纹图谱，借以探究该复方的体内药效成分，为揭示复方药效作用的物质基础提供试验依据。
3.1材料与仪器
3.1.1实验动物
SD大鼠，体质量220±30g，购自于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK(湘 2011-0003)。
3.1.2药物与试剂
乙腈为色谱纯，甲醇、磷酸均为分析纯，水为哇哈哈纯净水。各对照品分别为盐酸麻黄碱（批号171241-201007，质量分数》98%)、戸丁（批号100080-200707，质量分数>98%)、槲皮素（批号100081-201408,质量分数>98%)、五味子酵甲（批号110857-201412，质量分数》98%)均购自中国食品药品检定研究院；授皮素（批号，13061701，质量分数>98%)购自成都曼斯特生物公司。10批银黄清肺胶囊成品（批号S1: 130301、S2： 130401、S3； 140103、S4： 130503、 S5： 130101、 S6： 130103、 S7： 140101、 S8: 130501、 S9： 130303、S10： 130403)均由湖南安邦制药有限公司提供。
取SD大鼠20只，分为5组，每组4只，其中4组给给药组，1组为空白组，给药组分为低、中、高、极高4组（分别相当于成人临床等效剂量的1、2.5、5、10倍），给药组按lOmL/kg的剂量，每天灌予银黄清肺胶囊混悬液，空白组给予蒸馆水，均为1次/天，连续3天，第三天给药后，各组4只老鼠分别在0.5h、Ih、1.5h、2h用10%水合氯醛麻醉，腹腔主动脉取血血液置离心管中静置30min后，用4000r/inin高速离心lOmin，分离血清。各组取ImL血清，置离心管中，加入4mL乙腈，润旋振荡15min, 4000r/min离心lOmin，吸取上清液，将上清液用N2气吹干后，分别加入ImL甲醇溶解，过0.45 um微孔滤膜后使用HPLC分析。分析结果表明，5倍量给药剂量，1h取血的组合方案测得的HPLC图谱中血液移行成分最多，且浓度较高，最适于分析，故采用高剂量组给药剂量，且给药1h后采血。
第四部分总结与展望
4.1总结
总所周知，中药具有成分复杂，协同作用的特点，其药效物质基础与作用机制一直是人们关注的重点，尤其是中药复方的化学组成，更加复杂，对中药复方的化学成分进行研究，对阐明其作用机制，指导临床用药，具有重大的意义。银黄清肺胶囊是湖南安邦制药有限公司的独家品种，具有清肺化痰、止咳平喘的功效，主要用于治疗慢性支气管炎急性发作之痰热壅肺证。在临床上，作为治疗支气管炎急性发作的药物，具有较好的疗效。本论文以探究银黄清肺胶囊体内外物质基础为目的，采用HPLC、HPLC-MS等检测技术对制剂及含药血清样本进行了检测，为探索复方药效物质基础及阐明复方作用机制提供了试验依据。主要研究结果如下：
(1)建立了银黄清肺胶囊体外HPLC指纹图谱，检测到了 28个共有峰，其中12个成分通过对照品指认确定，并对28个峰中的26个峰归属到了各味药材，并使用了相似度和聚类分析等分析方法对10批成品样品进行了分析。
(2)采用HPLC-Q-TOF-MS/MS技术对银黄清肺胶囊制剂进行测定，正模式下检测到96种化合物，其中54种化合物通过查阅文献及质谱裂解规律结合的方法得到确认，并对复方所含的各类化学成分的裂解规律进行了初步的探讨。
(3)建立了银黄清肺胶囊健康动物含药血清HPLC指纹图谱，共检测到21个共有峰。并通过与空白血清与体外制剂HPLC图谱的比较，确定其中6个为血清固有成分，其佘15个成分为制剂原型成分及药物成分的代谢产物，并且通过对照品指认了其中5个制剂原型成分。
4.2取得的主要成果
(1)首次建立了银黄清肺胶囊HPLC指纹图谱。
(2)首次采用HPLC-Q-TOF-MS/MS技术对银黄清肺胶囊进行检测，探索其化学组成。
(3)首次建立了银黄清肺胶囊健康动物体内含药血清指纹图谱，探索通过口服给药方式的处方入血成分，为阐明复方物质基础和作用机制提供试验依据。
4.3展望
随着中医药事业现代化进程的加快，运用各种现代化技术和设备为中医药旳发展服务己经成为主流。一方面，指纹图谱等现代化的分析技术日益成为中药质量控制的主要手段，运用其整体性、特征性的特点，可以较全面的反映药物质量，并指导生产。另一方面，采用现代化的检测技术对中药的化学组成进行探索，对阐明中药的作用机制，指导临床用药，规范用药，具有重大的意义。但指纹图谱等技术也存在着各自的缺陷，如指纹图谱只能反映药物的化学信息，而不能反映生物信息，并且峰的纯度也不能很好的保证，在单一波长下无法全面反映药物化学组成等。在今后的指纹图谱研究中，应更加关注指纹图谱与药效相关性研究，即指纹图谱的生物等效性研究，阐明化学成分与有效成分相关性，避免与药理作用和临床疗效脱节，并且运用多维多息指纹图谱等能更加全面反映药物信息的新方法的发展也将成为研究的热点。
参考文献（略）