前言
随着人们生活节奏的加快、生活方式的改变，人们长期处于精神紧张和情绪波动等心理应激状态下，导致睡眠疾病逐渐变成影响人类健康最常见的病症之一[1]。睡眠是机体复原、整合和巩固记忆的重要环节，在生物机体中是一种本能行为，占据了人生大约1/3的时间，睡眠既能消除机体疲劳，恢复体力，又能增强学习和记忆，对维持种族延续和个体生存具有重要意义。在睡眠疾病中失眠最为常见，长时间失眠可导致人体免疫功能下降，容易引发如高血压、糖尿病、心脑血管疾病以及各类肠胃疾病，甚至会引发脑萎缩、老年痴呆、帕金森综合症、精神分裂等神经性疾病[2]。因此，对失眠症的治疗是现代医学研究的热点和难点之一。
目前药物治疗是治疗失眠旳重要方法之一。药物治疗在我国目前主要是镇静催眠药、中药及天然催眠物质三种[2]。近年来用中药干预睡眠疾病的研究多采用提高整体免疫力、抗应激能力和增强学习记忆的药物，由于其作用持久，治疗过程中毒副作用较小，临床应用越来越广[3]。从中药中蹄选改善睡眠药物，发挥中医药优势特点，对于提高中医药改善睡眠治疗的水平，开辟改善睡眠药物新思路具有重要意义[43]。本论文选择乌灵参作为研究对象，首次提出将乌灵参提取纯化后制备成滴丸的构想，利用中医药的独特优势和滴丸的特点改善睡眠的治疗。
我国民间称乌灵参、鸡揪蛋等。根据郞家林和《中国药用真菌》、《中国药用真菌图鉴》、《四川省中药材标准》等有关报道和文献资料记载，天然乌灵参性温、味甘，具补气固肾、健脾除湿、镇静安神之功效[7]。乌灵参是己知高等真菌中对神经及免疫系统功效最显著的菌类之一，被世界药用真菌研究、应用领域均视为珍稀、名贵药材，具有广泛的药用价值,加上深层培养技术制备乌灵菌粉的成功，为其定向生物转化工作打下了基础。乌灵参中含有腺苷、多糖、留醇类及谷氨酸、Y-氨基丁酸（GABA)、赖氨酸等19种氣基酸，还含有维生素和微量元素等多种成分[8，9]。核苦是具有生物活性的生物分子之一，其中的腺苷具有明显的药理活性，具有改善心脑血液循环、防止心率失常以及抑制神经递质释放等作用。实验表明，腺音是主要的睡眠诱导因子之一，它能抑制神经系1统兴奋性，促进睡眠。乌灵菌粗多糖有明显的脑保护作用，对电休克引起的记忆障碍也有保护作用。中国协和医科大学基础所试验表明，乌灵菌粗多糖可明显抑制小鼠脑内单胺氧化酶（MAO)活性，从而提高中枢神经递质功能[11]。氨基酸的组成以谷氨酸（Glu)含量最高，在作用机制的探讨研究中，丰富的Glu和少量的GABA，以及各种生物营养物质和维生素，可能是其发挥中枢镇静安眠作用的物质基础[12]。现代研究发现其药理作用主要体现在：（1)调节神经作用；（2)调节免疫作用[13]； (3)调节内分泌作用；（4)抗贫血作用等方面[14]。此外，研究表明乌灵参还具有抗氧化、清除自由基以及肝脏保护等作用。
本论文以多糖和腺苦为标志性成分，对浙江省佐力药业股份有限公司乌灵胶囊中乌灵菌粉与台湾康建生物科技股份有限公司的乌灵参子实体进行含量比较，最终选择台湾康建生物科技股份有限公司的乌灵参子实体为乌灵参滴丸的原料药。通过前期文献调研发现，国内外对乌灵参子实体的研究甚少，故本论文对乌灵参进行了提取及纯化工艺、制备工艺、质量标准、初步稳定性等系统研究，以期提高乌灵参的利用价值，研制出一种具有改善睡眠功效的乌灵参滴九。
第一部分处方前研究
建立科学、稳定、可靠及简便的定量分析方法是药物研究工作的前提。本部分内容首先对国内外文献进行调研，了解乌灵参的主要化学成分、药理活性及其目前的研究现状；其次以多糖为标志性成分，建立了乌灵参中多糖的紫外-可见分光光度含量测定方法，以腺苷为标志性成分，建立了乌灵参中腺苷的高效液相色谱含量测定方法；最后，以标志性成分旳含量为指标蹄选出乌灵参滴丸的原料药，并对原料药的理化性质进行研究，为提取/纯化工艺研究奠定基础。
一、实验材料
(一)实验药品与试剂
甲醇（批号13080417，美国天地，色谱纯）
氨水（批号20131201，杭州利人药业有限公司）
苯酷（批号20140126,上海凌峰化学试劍有限公司）
浓硫酸（批号20130106，浙江中星化工试剂有限公司）
腺苗（批号110879-200202，中国食品药品检定研究院）
桂胶GF254板（批号20121221，青岛海洋化工有限公司）
憐酸二氢钾（批号100301，湖州湖氏化学试剂有限公司）
乌灵胶囊（批号20130104，浙江佐力药业股份有限公司）
乌灵参（批号20140404,台湾康建生物科技股份有限公司）
乙醇（批号1212093601，安徽安特食品股份有限公司出品）
三氯甲烧（批号20100501/20090301,衢州巨化试剂有限公司）
D-无水葡萄糖（批号110833-201205，中国食品药品检定研究院）
纯净水（批号20140220，浙江娃哈哈昌盛罐头食品有限公司制造）
乙酸乙酯（批号20130108/20131117，江苏永华精细化学品有限公司）
二、方法与结果
(一)乌灵参体外分析方法的建立
1.多糖体外分析方法的建立
1.1溶液的制备
对照品溶液的制备：精确称取干燥至恒重的D-无水葡萄糖约3mg,置于25mL容量瓶中用蒸馆水稀释至刻度，摇匀，配制成浓度为0.1416mg/mL的葡萄糖溶液，备用。供试品溶液制备：称取乌灵参约0.5g，精密称定，精密加入50ml蒸懐水称定重量，置水浴中回流2小时，急速冷却，再称定重量，以水补足减失的重量(精确至O.Olg),摇勾，立即离心（3500转/分)，取上清液备用。
1.2测定波长的选择
以蒸馆水为溶剂，配置一定浓度的葡萄糖溶液，以蒸馆水为空白对照，置于lOmL具塞试管中，加水至2mL，加入6%苯酚溶液（棕色瓶冰箱冷藏）1mL，摇勾，迅速加入硫酸5mL，摇勾，置沸水浴中加热15分钟，同时作空白对照，冷却后于400-600nm范围内进行紫外扫描。
精密吸取供试品溶液0.16mL稀释定容至25mL，再移取稀释液2mL置于lOmL具塞刻度试管中，再加6%苯酷溶液1mL，摇勾，迅速加入硫酸5mL,摇匀，置沸水浴中加热15分钟，同时作空白对照，冷却后照分光光度法在486nm的波长处测定不同时间点样品的吸收度，结果表明，供试品溶液180min内的稳定性良好，见表1-2。
第三部分乌灵参滴丸制备工艺研究.....................27
一、实验材料.....................27
(一）实验药品与试剂.....................27
(二）实验器材.....................27
二、方法与结果.....................27
(一）单因素考察.....................27
1.药物的加入方式.....................27
第四部分质量标准研究.....................35
一、实验材料.....................35
(一）实验药品与试剂.....................35
(二）实验器材.....................35
二、方法与结果.....................36
(一）处方.....................36
第五部分初步稳定性研究.....................47
一、实验材料.....................47
(一）实验药品与试剂.....................47
(二）实验器材.....................47
二、方法与结果.....................48
(一）影响因素试验.....................48
第五部分初步稳定性研究
一、实验材料
(一)实验药品与试剂
甲醇（批号13080417,美国天地，色谱纯）
乌灵参滴丸（20140902/20140904/20140917，自制）
苯酚（批号20140126,上海凌峰化学试剂有限公司）
磷酸二氢钾（100301，湖州湖氏化学试剂有限公司）
浓硫酸（批号20130106,浙江中星化工试剂有限公司）
腺苷（批号110879-200202，中国食品药品检定研究院）
D-无水葡萄糖（批号110833-201205，中国食品药品检定研究院）
娃哈哈纯净水（20140220，浙江娃哈哈昌盛罐头食品有限公司制造）
乌灵参滴丸三批样品连续3个月初步稳定性考察，试验结果表明：产品的外观性状、含量测定均无明显变化，符合质量标准的各项规定，说明该制剂在存放期间，质量基本稳定。
本实验通过对影响因素试验、加速稳定性试验对乌灵参滴丸进行研究，获得该滴丸稳定性等的相关信息，并对其进行系统全面分析，为制剂最终确定包装材料，贮存条件及有效期提供参考价值。乌灵参滴丸外观性状对温度以及湿度具有一定敏感性，而光照对制剂稳定性无显著性影响。加速稳定性试验结果表明，产品的外观性状、含量测定较第“0”个月均无明显变化，符合质量标准的各项规定。
本部分通过影响因素以及加速稳定性试验结果的综合分析结果表明，该制剂对高温、高湿有一定敏感性，光照基本没有影响；加速稳定性考察项目检查发现，该制剂质量稳定，符合乌灵参质量标准的要求。
全文总结
根据文献记载乌灵参在改善睡眠方面在民间已有应用，因此本论文根据处方前研究结果选择乌灵参作为研究对象，首次将乌灵参进行提取、纯化并制备成生物利用度高、服用方便、稳定性好的滴丸制剂。本论文进行了处方前研究、提取工艺研究、纯化工艺研究、制备工艺研究及质量评价。全文总结如下：
乌灵参滴丸的制备工艺的研究。以圆整度、丸重差异、成型率等为指标，单因素考察了乌灵滴丸的生产工艺，确定乌灵滴丸的最佳工艺条件为：药物浓缩干粉100目，基质PEG2000: PEG4000比例2:1,药物与基质的比例1:1.5、溶融温度为80°C、冷凝剂的温度为30℃、滴距为10cm。所得滴丸外观呈棕褐色，色泽均勾，硬度适中，圆整度较好，且成型率高，工艺稳定可行。
乌灵参滴丸的质量评价。对乌灵参滴丸进行了质量评价。乌灵参滴丸呈棕褐色，色泽均勾，硬度适中，圆整度较好，且丸重差异、溶散时限均符合《中国药典》2010版规定。对腺苦进行了薄层鉴别，乌灵参滴丸供试品溶液在与腺苷标准品和对照药材相应位置上显相同斑点，而阴性样品无干扰。滴丸中多糖含量不低于为35.15g/100g，腺昔含量不低于81.2mg/100g。
乌灵参滴丸的初步稳定性研究该制剂对高温、高湿有一定敏感性，光照基本没有影响；加速稳定性考察项目检查发现，该制剂质量稳定，符合乌灵参滴丸质量标准的要求。
本课题对乌灵参提取及纯化工艺、制备工艺、质量标准、初步稳定性进行了系统研究，为进一步乌灵参滴丸的开发奠定了基础。但由于时间关系，有些工作还未完成（如初步药效学研究)，这些工作有待于进一步的努力。
参考文献（略）