第 1 章 绪 论
1.1 糖尿病概述
随着近年来人们生活水平的不断提高，糖尿病的患病率大幅度升高[3,4]。按照世界卫生组织和国际糖尿病联盟专家组建议，糖尿病的分型包括4类：Ⅰ型糖尿病（type 1diabetes mellitus, T1DM），Ⅱ型糖尿病（type 2 diabetes mellitus, T2DM），其他特异性糖尿病以及妊娠期糖尿病。糖尿病患者血糖控制不好容易引发包括眼、皮肤、心脏、肾脏及神经系统在内的多组织、器官的并发症，导致失明、下肢坏疽、动脉粥样硬化、中风、肾衰等，影响患者的生命质量，甚至危及生命[5]。
1.2 传统降糖药与新型降糖药
1.2.1 传统降糖药
传统治疗糖尿病药物包括胰岛素和口服降糖药。1921 年胰岛素（insulin）被发现后，各类胰岛素制剂的研究进展迅速[6]。非注射型胰岛素，改善了给药方式，但同时存在许多不良反应（如鼻腔给药刺激对鼻粘膜等）。而速效和长效胰岛素类似物的出现提高了胰岛素用药的针对性等[7]。
口服降糖药主要有以下几类：
1．促胰岛素分泌剂，传统的促进胰岛素分泌剂是磺酰脲类（sulfonylureas, SUs），代表药物格列本脲（glibenclamide），但一些非磺酰脲类药物也有类似于磺酰脲类的作用机制，例如瑞格列奈为苯甲酸衍生物也具有促进胰岛素的分泌的作用[8]。
2．双胍类（biguanides），代表药物二甲双胍（metformin），是目前临床上治疗T2DM 的最常用的双胍类药物，尤其对肥胖伴有高胰岛素血症的患者疗效更佳，但是它通常伴有严重的不良反应[9]。
3．α-葡萄糖苷酶抑制剂（α-glucosidase inhibitor），代表药阿卡波糖（acarbose），血糖反应。其主要不良反应有腹胀，偶有腹泻等消化道反应，与胰岛素或磺酰脲类使用时会增加低血糖危险。
4．噻唑烷二酮类（thiazolidinediones, TZDs）胰岛素增敏剂，代表药罗格列酮（rosiglitazone），为过氧化物酶体增殖活化受体（PPAR）的激动剂，能降低肝糖产生，改善细胞或组织对胰岛素的敏感性，增加肝脏对葡萄糖的摄取，降低极低密度脂蛋白（very Low-density lipoprotein, VLDL）和甘油三酯（Triglyceride, TG）水平，升高高密度脂蛋白（High-density lipoprotein, HDL-C）水平，增加胰岛素敏感性，改善胰岛素抵抗[11]。
1.2.2 新型降糖药
近年出现一些新型促胰岛素分泌剂和改善糖代谢的药物，新型促胰岛素分泌剂主要采用基因工程或 DNA 重组的方法合成[12]。现在研究较多的主要由以下几种。
1．胰高血糖素样多肽-1（glucagons-like peptide-1, GLP-1）具有改善胰岛细胞功能，促进胰岛细胞增殖/抑制胰岛细胞凋亡，Amylin 公司和 EliLilly 公司共同研发的Exenatide（商品名: Byetta）是首个上市的 GLP-1 受体激动剂[13]。
2．二肽基肽酶-4（DPP-4）抑制剂具有增加 GLP-1 活性和改善脂质代谢，控制血糖水平[14]，目前已经上市的 DPP-4 抑制剂有默克公司的西他列汀（sitaglipin）和诺华公司的维格列汀（vildagliptin）[15]。
3．钠-葡萄糖转运子（sodium glucose co-transporter 2, SGLT2）抑制剂抑制葡萄糖的重吸收降低血糖，目前处在研究阶段的 SGLT2 抑制剂有 dapagliflozin 和sergliflozin[16]。
4．葡萄糖激酶（glucokinase activators, GK）激动剂通过促进葡萄糖的利用控制血糖水平。GK 是糖酵解途径中的关键酶，在控制血糖的平衡和代谢中起着重要的作用[17]，目前正在进行临床研究的葡萄糖激动剂药物有罗氏公司的 RO438962 和RO281675。
5．蛋白酪氨酸磷酸酶 1B（PTP1B）抑制剂是蛋白酪氨酸磷酸酶是家族的一员，PTP1B 抑制剂是各国研究的热点，大多还处于临床研究阶段，目前尚未有上市药物出现[18]。
氧化应激（oxidative stress）是指活性分子例如活性氧簇（ROS）和活性氮簇（RNS）等的过度生成和/或清除减少，从而造成体内活性氧类生成与抗氧化防御功能之间平衡的紊乱[19,20]。在生理状态下，自由基的产生和清除保持平衡；在病理条件下，自由基大量产生，能引起脂质过氧化、细胞内蛋白和酶的变性、DNA 损害，导致细胞死亡或凋亡，进一步造成组织损伤，疾病发生[21-24]。氧化应激与糖尿病及其并发症的发生和发展密切相关。研究发现，高血糖以及同时伴有糖化和脂质过氧化物可引起氧化应激，损伤自身的抗氧化系统[25,26]。糖尿病氧化应激产生的主要机制有葡萄糖自身氧化、蛋白质的非酶糖化、多元醇通路的激活、蛋白激酶 C 的激活、线粒体氧化磷酸化、抗氧化能力减弱等。线粒体呼吸链中产生的 ROS 已经被证实肿瘤坏死因 α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）和 IL-1是激活核因子-κB（nuclear factor-kappa B, NF-κB）通路的第二信使[27]。ROS 可通过激活 MAPK（mitogen-activated protein kinases, MAPK）信号通路使 NF-κB 抑制蛋白（ Inhibitory protein of NF-κB,IκB）磷酸化，激活 NF-κB[28]。
第 2 章 实验内容
2.1 实验材料
2.1.1 实验药物结构实验药物瑞格列奈和吲哚美辛，结构如下：
2.1.2 实验动物及饲料
SD 大鼠，雄性，体重 200±20 g，SPF 级，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号：SCXK -（京）- 2009-0017。饲养在 12 h昼夜循环，温度 22±2℃，湿度 55±5%的房间里，自由摄食饮水。饲料由北京科奥协力饲料有限公司提供，合格证号：SCXK（京）2005-0007。
2.2 实验方法
2.2.1 溶液的配置
1）柠檬酸盐缓冲液（pH4.4）
分别称量柠檬酸、柠檬酸钠 2.1 g，2.94 g，分别用双蒸水于 100mL 容量瓶中定容，配置为溶液；取上述柠檬酸溶液 56 mL，柠檬酸钠溶液 44 mL，混匀，用 PH 计将 pH值调为 4.4，混合用 22 μm微孔滤膜过滤灭菌，4℃冰箱保存备用。
2）链脲佐菌素（STZ, 60 mg/kg）
临注射前，用已配置好的 pH 为 4.4 的柠檬酸缓冲液为溶剂配制浓度为 2%的 STZ溶液，配置完成后快速注射（15 min内）。
3）0.5% CMC-Na 溶液配制
量取 500mL 蒸馏水于烧杯中，加热至 60℃，将 2.5gCMC-Na 缓慢加入水中，继续加热搅拌直至粉末全部溶解。
4）瑞格列奈和吲哚美辛混悬液配制
将受试药物瑞格列奈 6 mg溶于 12 ml 0.5% CMC-Na，配制成浓度为 0.5 mg/mL的瑞格列奈混悬液；吲哚美辛5 g溶于66.5 mL 0.5% CMC-Na，配制成浓度为75 mg/mL的吲哚美辛混悬液。
2.2.2 糖尿病大鼠模型的制备
64 只雄性 SD 大鼠，适应性饲养一周后，实验前用血糖仪测定大鼠血糖，血糖正常大鼠做为入选动物，随机分为正常对照组、正常给药组、建模组。建模组的大鼠禁食 12 h后一次性腹腔注射 STZ（60mg/kg），正常对照组和正常给药组的大鼠腹腔注射等体积的柠檬酸钠缓冲液。72 h后和 1 周后采用血糖仪测定各组大鼠的血糖水平，糖尿病大鼠的成模诊断标准为两次空腹血糖值 ≥ 11.1 mmol/L，剔除未达标准的大鼠，糖尿病成模大鼠二次随机分组，模型组、瑞格列奈组、吲哚美辛组。正常给药组和瑞格列奈组的大鼠均给予瑞格列奈 1 mg/kg/d，吲哚美辛组的大鼠给予吲哚美辛 5mg/kg/d；正常对照组与模型组给予同等体积的 CMC-Na，每天灌胃一次。试验期间，分笼饲养，每笼 2 只，给予充足的的水和食物，每天上午和晚上换两次垫料。给药 4周后处置一半动物，另一半动物继续给药，至给药 8 周后处置，观察各组大鼠相应指标的变化。
2.2.3 观察及检测的主要指标
1）观察在给药期间各组大鼠的状态、精神活动、毛色、排泄等基本情况，解剖后观察各组大鼠的主要脏器的变化情况，称量各组大鼠脏器的脏器质量，并计算脏器系数。
2）每周监测各组大鼠的体重、空腹血糖、24 h 摄食量和 24 h 饮水量变化。
3）检测各组大鼠血清中胰岛素水平。
4）检测各组大鼠血清中氧化应激相关指标超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽还原酶（GSH）、丙二醛（MDA）、过氧化氢（H2O2）的变化。
5）检测各组大鼠血清中相关炎症因子及蛋白—血清中 C 反应蛋白（CRP）、白细胞介素 6（IL-6）、肿瘤坏死因子 α（TNF-α）、核因子 κB（NF-κB）、转录因子激活蛋白 1（AP-1）水平的变化。
第 3 章 实验结果.............................................18
3.1 大鼠一般状态观察......................................... 18
3.2 实验期间大鼠血糖和体重的变化................................ 18
3.2.1 瑞格列奈给药 4 周大鼠体重和血糖的变化 ................... 18
3.2.2 瑞格列奈给药 8 周大鼠血糖和体重的变化 .................. 20
3.3 瑞格列奈对大鼠饮水量和摄食量的影响........................ 22
3.3.1 瑞格列奈给药 4 周大鼠饮水量和摄食量的变化 .............22
3.3.2 瑞格列奈给药 8 周大鼠饮水量和摄食量的变化 .............. 23
第 4 章 讨 论..................................................47
结 论.........................................................52
第 4 章 讨 论
根据世界卫生组织和国际糖尿病联盟专家组的建议，糖尿病的分型包括4类：①Ⅰ型糖尿病：是由自身免疫反应引起的，机体的防卫系统攻击胰腺中产生胰岛素的β细胞，致使机体无法合成其所需的胰岛素，胰岛素绝对缺乏；②Ⅱ型糖尿病：胰岛素抵抗为主伴胰岛素相对缺乏，或胰岛素分泌缺陷为主伴胰岛素抵抗；③其他特异性糖尿病：由遗传、外伤、内分泌疾病及药物等多种特殊原因造成的糖尿病；④妊娠期糖尿病。其中Ⅰ型糖尿病典型症状为“三多一少”，即多饮多食多尿。
本实验结果显示，模型组和瑞格列奈组的大鼠出现多饮多食多尿、逐渐消瘦症状，无死亡。瑞格列奈组的大鼠皮毛欠光泽偏黄，精神萎靡，活动差，反应迟缓，出现“三多一少”症状，无死亡。吲哚美辛组的大鼠，第7周死亡1只，第8周死亡2只，8周处置动物时剩余2只，数量过少，因此8周的吲哚美辛组的实验结果未进行统计学分析。死亡原因可能是糖尿病大鼠存在葡萄糖吸收的问题，而非甾体抗炎药（Nonsteroidalanti-inflammatory drugs, NSAIDs）吲哚美辛长期服用易引起胃黏膜损伤的消化道不良反应，进一步加重糖尿病大鼠葡萄糖吸收的问题，使能量严重不足，导致死亡。
瑞格列奈为临床上常用的口服降糖药，促进胰岛素的分泌，明显降低Ⅱ型糖尿病患者的餐后血糖。根据已有报道和本实验室的研究结果，瑞格列奈对Ⅱ型糖尿病具有一定的抗氧化和抗炎作用，但其作用是否独立于降糖作用之外，以及抗炎作用是否与瑞格列奈促进胰岛素的分泌有关尚不明确。本文一次性腹腔注射大剂量STZ建立Ⅰ型糖尿病模型，模型组、瑞格列奈组和吲哚美辛组的血清胰岛素水平和血糖水平显著高于正常对照组；药物干预后，瑞格列奈组的大鼠胰岛素水平和血糖水平与正常对照组比未有明显改变，与模型组无统计学差异。瑞格列奈组的大鼠血糖并未出现明显改变是由于瑞格列奈组的大鼠胰岛β细胞已经大部分被破坏，瑞格列奈无法发挥促进胰岛素分泌的功能，胰岛素的绝对缺乏使血糖无法降低。给药8周，模型组和瑞格列奈组的大鼠第8周体重、摄食量、饮水量急剧下降，可能是由于建立的血糖模型血糖过高且长时间处于高血糖的状态，加速疾病的进程引起。
炎症学说认为糖尿病是一种低度慢性炎症，糖尿病血管并发症是糖尿病患者致死致残的主要原因。英国前瞻性研究证实，血糖控制良好并不能明显降低糖尿病患者大血管并发症的发生。本实验结果显示瑞格列奈可以明显改善炎症反应，可能对预防或延缓糖尿病并发症具有潜在的作用。促胰岛素分泌剂瑞格列奈是一类苯甲酸类衍生物，已有研究报道这类化和物可能具有抗氧化活性[58,59]，瑞格列奈的化学结果决定了其可能具有抗氧化的能力；本实验室前期研究显示瑞格列奈可以明显改善 T2DM 大鼠的氧化应激；胰岛素可通过下调内皮细胞粘附因子的表达调节炎症[68]。因此，推测瑞格列奈的这种抗氧化作用可能是其本身具有抗氧化作用；也可能与其对餐后血糖的控制，抑制葡萄糖进入细胞及抑制葡萄糖自身氧化有关。瑞格列奈的抗炎作用可能与其控制餐后血糖有关；可能与其刺激胰岛 β 细胞分泌胰岛素，升高胰岛素水平有关；也可能与抗氧化作用相关；还可能是多种因素作用的结果。
结 论
本实验通过一次性注射大剂量STZ的方法，建立实验型糖尿病大鼠模型，给予受试药物瑞格列奈，观察其对DM大鼠体重、血糖、脏器系数、血清氧化应激指标和炎症相关因子的影响，得出以下结论：
1．瑞格列奈增加T1DM大鼠SOD活性和GSH含量，降低MDA、H2O2的含量，明显改善氧化应激。但其并不是通过直接增加SOD的活性和GSH的含量，可能是通过其它机制减少SOD的消耗，减少NADPH的过度消耗，缓解对GSH生成的抑制，使SOD活性和GSH的含量相对增加。
2．瑞格列奈降低 T1DM 大鼠血清中 CRP 和 TNF-α 的含量，可以明显改善炎症反应。
3．瑞格列奈的抗氧化和抗炎作用与降糖作用并无直接的关系；瑞格列奈抗炎作用与胰岛素水平无明显关系，主要与抗氧化作用相关。
4．瑞格列奈降低T1DM大鼠血清中NF-κB和AP-1水平，可能通过打破氧化应激-炎症-氧化应激的恶性循环，降低NF-κB、AP-1的过度表达，进而调控炎症基因转录过程中的调控因子，改善炎症反应。
瑞格列奈对 NF-κB 的抑制作用是直接抑制，是通过抑制 IκB 的磷酸化；是通过抑制蛋白酶体活性，抑制磷酸化和泛素化的 IκB 的降解；是通过抑制 NF-κB 核易位，阻断与 IκB 解离的 NF-κB 移入核内；是通过磷酸化 NF-κB 的 p65 亚单位引起结构的改变；亦或是通过其它机制达到抑制 NF-κB，仍需进一步研究。瑞格列奈对 AP-1 的抑制作用是直接作用于 AP-1，是通过抑制 MAPK 通路，亦或是通过其它机制，其具体机制仍需深入研究。
参考文献（略）