第一章 文献综述
1.1 分子分型技术在乳酸菌鉴定及多态性研究中的应用
乳酸菌是一类以碳水化合物为碳源，并能产生 50%以上乳酸的革兰氏阳性无芽孢细菌的总称(Konings et al. 2000)。乳酸菌种类繁多，具有很高的经济价值，已在食品工业、医疗保健、饲料发酵及畜禽疾病防治等方面得到广泛应用(Furet et al. 2004)。不同的产品对乳酸菌的使用方法各异，有的采用自然发酵，如酸泡菜；有的采用混菌发酵，如酸乳及其系列产品；也有单菌生产、混合应用的，这在医疗保健、饲料发酵及畜禽疾病防治等方面应用较多。为了了解乳酸菌在这些产品中或乳酸菌产品被使用后的动态规律，需要对不同阶段的乳酸菌进行分离鉴定，并进行定量。其次，乳酸菌耐药性的出现并呈现逐渐增强的趋势给食品和药品安全带来潜在威胁，因此对乳酸菌的应用存在担忧。为了保证乳酸菌的应用安全，需要选择使用安全的菌种或菌株，因此，快速鉴定和筛选优良的乳酸菌极为重要。传统的乳酸菌分类鉴定方法建立在乳酸菌形态和生理生化特征基础上，这种方法不但耗时耗力、工作量大，有时还难以进行有效的区分和鉴别，已不能适应当前乳酸菌分类学的快速发展。随着分子生物学技术，尤其是基于分析基因组 DNA的 PCR、电泳及核酸测序技术的不断改进与完善，DNA 分子分型技术以其快速、准确、灵敏的优点逐渐被用于乳酸菌的鉴定(McCartney 2002)。当前应用于乳酸菌鉴定和多态性研究的 DNA 分子分型技术很多，本文对几种常用的 DNA 分子分型技术的原理、步骤及优缺点进行了阐述，并对它们近几年在乳酸菌中的应用进行了介绍，以期对乳酸菌鉴定及多态性研究提供一定的帮助。
1.2 细菌药物敏感性试验方法研究进展
随着抗菌药物的广泛使用，耐药细菌不断出现，细菌的耐药性也不断增强(Teuber et al.1999)。耐药菌，尤其是多重耐药菌的不断增加，给人和动物疾病的治疗带来了极大困难(Walther et al. 2008)。细菌耐药性的产生和传播，引起了全世界的普遍关注，被世界卫生组织认为是 2l 世纪最大的公共卫生安全问题之一(Levy 2001)。因此，对细菌耐药性的检测、监测和评价就非常必要且十分迫切。
细 菌 耐 药 性 的 研 究 方 法 包 括 药 物 敏 感 性 试 验 (Di Bonaventura et al. 2002;Valpieso-García et al. 2009) 、质粒消除试验及质粒指纹图谱技术 (Bennett 2008;Chandrasekaran and Lalithakumari 1998)、基因探针技术(Archer and Pennell 1990; Ligozzi etal. 1991)、PCR 技术(Malhotra-Kumar et al. 2005; Strommenger et al. 2003)、RT-PCR 技术(Grape et al. 2007; Torres et al. 2003)、基因芯片技术(Frye et al. 2006; Perreten et al. 2005)等，其中，细菌的药物敏感性试验是目前各实验室最为常用的细菌耐药性测定方法。测定抗菌药物在体外对微生物有无抑制作用的方法称为药物敏感性试验，简称药敏试验(凌代文 1999)。细菌药敏试验常用方法按其效果可分为测量药物最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)的肉汤稀释法和琼脂稀释法，测量含药纸片抑菌圈直径大小的 K-B(Kirby-Bauer)纸片琼脂扩散法及稀释法和扩散法相结合的 E-test 试验(Epsilometer-test)。在此，笔者就以上 4 种常用的细菌药敏试验方法的原理、步骤进行了介绍，并对各自的优缺点进行了分析。
1.3 乳酸菌耐药性及耐药基因水平转移
近年文献陆续报道食品中使用的乳酸菌有的也产生了耐药性，并有增强趋势，甚至在有些耐药株中已检测到抗性基因(D'Aimmo et al. 2007;小部分抗性基因位于染色体上，更多的耐药基因则位于可移动的非染色体遗传因子上。细菌常见的可移动遗传因子包括转座子、质粒、噬菌体及整合子-基因盒系统等；这些可移动元件使乳酸菌基因具有可变性，从而造成乳酸菌耐药性广泛传播(徐海花等 2010)。 Liu et al. 2009)。
乳酸菌耐药性包括固有耐药性和获得性耐药性。固有耐药性是指细菌天生对抗生素不敏感，是细胞固有的稳定的遗传特性，耐药基因常位于染色体上。获得性耐药性是指细菌在抗菌药物的选择性压力下经过基因突变、潜伏基因的表达，或细菌通过质粒或转座子等基因水平转移方式获得外源抗性基因并表达，从而表现耐药特性(Tenover 2006)。质粒是细菌细胞内一种自我复制的环状双链 DNA 分子，能稳定地独立存在于染色体外。质粒一般不整合到宿主染色体上。耐药质粒可通过转化(Transformation)、接合(Conjugation)、转导(Transduction)等方式在细菌间传递。转化是指含耐药基因的细菌溶解后，将其自身的 DNA 释放，当含耐药基因的 DNA 进入敏感菌后，耐药基因与敏感菌的基因组合，敏感菌转化为耐药菌。接合是指通过耐药菌与敏感菌菌体接触后，耐药菌将自身的耐药基因传递到敏感菌中，使敏感菌具有耐药性。细菌通过接合，可在一次便完成一种或多种抗生素抗性的转移。在革兰阴性细菌特别是肠道菌间接合的发生较为常见。转导是指耐药基因通过噬菌体转移至受体菌的过程，然而由于噬菌体具有特异性，且噬菌体能传播的 DNA 量较少，因此转导仅可以在同种细菌内发生，并且只可以传递一种抗生素的耐药性(杨霞等 2007)。
转座子(transposon，Tn)是一种比质粒更小的 DNA 片段，它可以在染色体中跳跃移动，或在同一细胞中的染色体与质粒间移动，通常通过复制插入到新的位点，也可以将自身从原位点剪切掉再插入到新的位点，使结构基因的产物大量增加，从而使宿主细胞失去对抗菌药物的敏感性(夏永祥和陈杰 2010)。Tn 还可以使位于染色体上和非接合质粒上的基因转移到接合质粒中，因此实现细菌间的转移或交换。转座子可在革兰阴性菌和革兰阳性菌之间转移，是耐药基因传播的一个重要途径。
第二章 乳酸菌分离与鉴定............................................15
2.1 材料与方法............................................... 15
2.2 结果与分析............................................................... 19
2.3 讨论................................................................. 23
第三章 乳酸菌药物敏感性分析.....................................................25
3.1 材料与方法............................................................................ 25
3.2 结果与分析................................................................................ 29
3.3 讨论....................................................................... 33
第四章 抗性基因检测........................................................................35
4.1 材料与方法................................................................... 35
4.2 结果与分析.......................................................................... 38
4.3 讨论......................................................................................... 39 4.4 小结................................................................ 39
第五章 乳酸菌 RAPD 分型.....................................................40
5.1 材料与方法......................................................... 40
5.2 结果与分析......................................................... 41
5.3 讨论............................................................ 43
5.4 小结........................................................................ 44
第六章 结论与展望..................................................45
6.1 结论.................................................................. 45
6.2 展望.............................. 45
参考文献................................................47
第六章 结论与展望
6.1 结论
(1)通过细菌培养、生化鉴定以及 16S rDNA 鉴定等方法，从不同地区的酸奶中分离得到 18 株保加利亚乳杆菌和 25 株嗜热链球菌。
(2)采用琼脂稀释法评价了 43 株受试乳酸菌对 11 种抗生素的药物敏感性，通过测定的最低抑菌浓度与耐药折点比较判定每株菌敏感或耐药。药敏试验结果表明，43 株受试菌株对 11 种抗生素表现出不同程度的耐药，多重耐药现象较为严重。
(3)采用 PCR 扩增技术检测了抗生素耐药菌株中常见的抗性基因。检测结果表明，在全部 28 株四环素耐药菌株中共检测到 3 株菌含有四环素抗性基因 tet(M)，检出率10.7%；在全部 32 株链霉素耐药菌株中共检测到 4 株菌含有链霉素抗性基因 ant(6)，检出率 12.5%；在全部 43 株卡那霉素耐药菌株中共检测到 7 株菌含有卡那霉素抗性基因aph(3')-IIIa，检测率 16.3%。(4)通过对 dNTP 浓度、Mg2+浓度、引物及其浓度、模板 DNA 浓度等因素的不断优化，建立了 RAPD 分型技术的最优反应条件：(25μLPCR 反应体系)Mg2+浓度：2mM；dNTP 浓度：200μM；引物(CRA23)浓度：2μM；Taq 酶：1.25U；模板 DNA：50-100ng。在该条件下，引物 CRA23 具有较强的分辨能力，RAPD 能快速、稳定的分析分离株的多样性。分型结果显示，43 株受试菌具有较高的遗传多样性。
6.2 展望
近几十年来，由于抗生素在临床上的广泛使用，致病菌的耐药性逐渐增强，这对疾病的预防与治疗带大极大的困难。近年来，致病菌的耐药性已被广泛研究，其耐药机制与耐药基因的转移也多见报道。然而，研究发现食品中使用的乳酸菌也产生了耐药性，并有增强趋势，甚至在有些耐药株中检测到抗性基因。乳酸菌耐药性包括固有耐药性和获得性耐药性。固有耐药性是指细菌天生对抗生素不敏感，是细胞固有的稳定的遗传特性。获得性耐药性是指细菌在抗菌药物的选择性压力下经过基因突变、潜伏基因的表达，或细菌通过转化、转导或接合等基因水平转移方式获得外源抗性基因并表达，从而表现耐药特性。乳酸菌可能或已经成为抗性基因的受体或作为供体向其他细菌转移抗性基因的中介体。酸奶作为日常食用的奶制品，其良好的口感以及所含乳酸菌的益生功能深受人们喜爱，因此在人体胃肠道内，食用乳酸菌有可能通过自身基因突变和捕获外源耐药基因产生耐药性，也可将耐药基因通过质粒、转座子、整合子传递到在肠道或环境中与其共存的其他致病菌，使致病菌获得耐药性或导致致病菌抗性增强，给疾病的治疗带来困难。对食品中乳酸菌的耐药性及耐药性水平传递的研究可以为现今不断加重的乳酸菌耐药现象提供理论依据和正确的指导，保障人类的健康。作者认为进一步的研究应主要集中在抗性基因能否转移给肠道致病菌以及转移的方式和机制。