第一部分 基于 Ag-TNT/P-rGO 纳米复合物的 signal-off 型电化学适体传感器的制备及其对细菌内毒素的检测研究
1.1 引言
细菌内毒素，通常也称为脂多糖（LPS），是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分[1]。LPS 为外源性致热源，极少量即可引起发热反应，过量时可导致微循环障碍，败血性休克，弥漫性血管内凝血，甚至最终导致死亡[2-4]。 因此，大多数国家都严格规定了药品中 LPS 的限量[5]。例如，中国药典（ChP）明确规定了各药品和生物制品中内毒素的最大限量。美国食品药品监督管理局（FDA）规定 0.2 EU（内毒素单位）为每公斤体重药物分配的极限[6]。所以，建立一种高灵敏度和强特异性的 LPS检测分析方法意义重大。
兔热原试验是用于 LPS 检测的第一种方法，但由于其具有个体差异，灵敏度低和耗时的缺点，已逐渐被基于酶促反应的鲎溶解物（LAL）试验取代。然而，LAL试验也存在一些弊端，如假阳性率较高、反应条件苛刻和检测试剂较难获得等[7, 8]。在这种背景下，各种生物传感器因其响应迅速和检测效率高等特点被广泛研究并用于 LPS 检测，其中，电化学生物传感器因其独特的性能而备受关注，并成为生物分析和医疗诊断领域的重要工具[9]。电化学生物传感器用于检测 LPS 是以不同LPS 亲和成分为基础的，这些亲和成分包括蛋白质[10]，肽[11]，抗体[12]和适体[13]等。其中，适体是一种通过体外筛选（SELEX）技术得到的寡核酸链，因其与靶标具有高亲和力，制备过程简单以及能够长期保存等优点而被广泛应用。本文的目的就是构建一种基于 LPS 结合适体（LBA）的电化学适体传感器用于 LPS 的痕量检测。
为了电化学适体传感器能够超灵敏检测分析物，需要设计信号放大策略。近年来，纳米材料因其具有独特而卓越的电活性而被广泛研究并用于信号放大以改善电化学生物传感器的检测性能。其中，贵金属/半导体复合物在纳米电子学和化学传感中具有广泛的应用[14]。
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1.2 材料与方法
1.2.1 试剂材料
内毒素标准品和聚二烯丙基二甲基氯化铵（PDDA，20 wt%）购自 Sigma-Aldrich公司（美国）；二氧化钛（TiO2）购自麦克林生物化学有限公司（中国上海）；硼氢化钠（NaB H4）购自科龙化工有限公司（中国成都）；硝酸银（AgNO3）购自上海化学试剂有限公司（中国上海）；氧化石墨烯（GO）购自先丰纳米有限公司（中国南京）；牛血清蛋白（BSA）购自 J&K 科学有限公司（中国北京）；维生素 B1注射剂由重庆医科大学附属第一医院提供（中国重庆）；LPS 的适配体（LBA）由生工生物工程股份有限公司（中国上海） 合成， 其详细的碱基序列如下：
5′-NH2-(CH2)6-CTTCTGCCCGCCTCCTTCCTAGCCGGATCGCGCTGGCCAG ATGATATAAAG GGTCAGCCCCCCAGGAGACGAGATAGGCGGACACT-3′
含有 140 mM NaCl，5 mM KCl，1 mM MgCl2和 1 mM CaCl2的 20 mM Tris-HCl 缓冲液（pH 7.4）用于溶解和稀释适体。0.1 M 磷酸盐缓冲液（PB，pH 7.0）含有 2 mM MgCl2和 10 mM KCl。 所有化学用品均为分析纯，实验过程用水为电阻率 18.2 MΩ·cm 的超纯水。
1.2.2 仪器设备
所有的电化学测量均在传统的三电极系统中完成：修饰的金电极（GE，直径4 毫米）为工作电极，饱和甘汞电极（SCE）为参比电极和铂丝为辅助电极。 在 0.1 M PB（pH 7.0）中通过循环伏安法（CV）对不同的修饰电极进行测量，扫描速率为 0.1 V/s，电压范围为-0.3~0.5 V。
药学论文参考
第二部分 基于亲和素-生物素系统和 MOF/Ag-P-N-CNTs 纳米复合物的 signal-on 夹心型电化学适体传感器的制备及其对细菌内毒素的检测研究
2.1 引言
电化学传感技术具有响应快速，操作简便和成本低等优点[45]，适体又具有选择性强，易于合成和性质稳定等优点[13]，电化学适体传感器则结合了上述两者的优点从而在化学分析领域备受瞩目。根据目标物与适体特异性结合后电化学信号的响应情况可将电化学适体传感器分为以下两类：目标物与适体特异性结合后造成信号衰减的 signal-off 型[46]和目标物与适体特异性结合后引起信号增强的 signal-on 型[47]。Signal-off 型电化学适体传感器一般构建过程相对简单，但抗干扰能力弱，假阳性率较高，因而限制了传感器的灵敏度[48, 49]。而 signal-on 型电化学适体传感器抗干扰能力强，能有效克服 signal-off 型电化学适体传感器存在的缺点，灵敏度更高，并且具有适体-目标物-适体夹心结构的 signal-on 夹心型电化学适体传感器对具有多个结合位点的大分子目标物如 LPS 更为适用[50]。
另外，随着纳米技术的飞速发展，纳米复合物因其优异的性能被广泛研究并应用于放大检测信号以提高传感器的灵敏度[51]。碳纳米管（CNTs）因其具有独特的电活性，优异的化学稳定性，尺寸小比表面积大等优点而在构造传感器方面备受青睐[52]。银纳米颗粒（AgNPs）同样也经常被用于构建生物传感器，因为它不仅具有贵金属纳米颗粒的典型特征，而且具有出色的氧化还原活性[53]。许多以 CNTs 或表面改性的CNTs 为载体负载AgNPs 的纳米复合物被用于生物传感器的构建[54, 55]。值得一提的是，与 CNTs 相比，氮掺杂碳纳米管（N-CNT）的反应活性和分析性能更好[56, 57]。此外，N-CNTs 还是金属纳米颗粒的优质载体，其中的氮原子为金属纳米颗粒提供了丰富的结合位点[58]。用 N-CNTs 来负载和分散 AgNPs 可以提高传感器的检测灵敏度[59]。另外，用具有固有电荷迁移率和高灵敏度的导电聚合物如PDDA 功能化 CNTs 可以避免 CNTs 发生团聚，从而增强稳定性[60, 61]。
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2.2 材料与方法
2.2.1 试剂材料
内毒素标准品、氯金酸（HAuCl4）和聚二烯丙基二甲基氯化铵（PDDA）购自Sigma-Aldrich 公司（美国）；硼氢化钠（NaBH4）、硝酸银（AgNO3）、氯化钠（NaC l）、抗坏血酸（AA）和磷酸二氢钠（NaH2PO4）购自科龙化工有限公司（中国成都）；牛血清蛋白（BSA）购自 J&K 科学有限公司（中国北京）；链霉亲和素（SA）、六水合氯化铁（FeC l3·6H2O）和亚硫酸氢钠（NaH SO3）购自上海阿拉丁生化科技有限公司（中国上海）；N，N-二甲基甲酰胺（DMF）购自麦克林生物化学有限公司（中国上海）；氮掺杂碳纳米管（N-CNTs）购自先丰纳米有限公司（中国南京）；EDTA-2Na 购自索莱宝科技有限公司（中国北京）；半胱氨酸购自光复化工研究所（中国天津）；维生素 C 注射剂由重庆医科大学附属第一医院提供（中国重庆）。所有化学用品均为分析纯，无需进一步纯化即可直接使用。整个实验过程中用水为电阻率 18.2 MΩ·cm 的超纯水。LPS 结合适体由生工生物工程股份有限公司（中国上海）合成，其详细的碱基序列如下：
生物素化的捕获探针 (BCPs): 5´-Biotin-CTTCTGCCCGCCTCCTTCCTAGCC GGATCGCGCTGGCCAGATGATATAAAGGGTCAGCCCCCCAGGAGACGAGATAGGCGGACACT-3´
巯基化的信号探针(TSPs): 5´-SH-(CH2)6-CTTCTGCCCGCCTCCTTCCTAGCC GGATCGCGCTGGCCAGATGATATAAAGGGTCAGCCCCCCAGGAGACGAGATAGGCGGACACT-3´ 包含 0.1 M KCl 的 5 mM [Fe(CN)6]3-/4-溶液为表征电极构建过程的缓冲液；0.1 M 磷酸盐溶液（PB，pH 7.0）为表征 tracer label 信号响应的缓冲液；10 mM TES溶液（pH 7.4）用来溶解和稀释 BCPs
包含 10 mM TCEP 的 10 mM TES（pH 7.4）溶液用来溶解和稀释 TSPs。
药学论文怎么写
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第二部分 基于亲和素-生物素系统和 MOF/Ag-P-N-CNTs 纳米复合物的 signal-on夹心型电化学适体传感器的制备及其对细菌内毒素的检测研究.....24
2.1 引言 ............... 24
2.2 材料与方法 .................................. 25
2.2.1 试剂材料 ............................... 25
2.2.2 仪器及参数 ..................................... 26
2.2.3 Fe-MOF 的制备 ................................ 26
2.2.4 MOF/Ag-P-N-CNTs 纳米复合物及 tracer label 的制备 ............... 27
全文总结 ................................ 40
讨论
本文构建了基于亲和素-生物素系统和 MOF/Ag-P-N-CNTs 纳米复合物为信号放大材料的 signal-on 夹心型电化学适体传感器并成功用于 LPS 的检测。首先，信号放大材料 MOF/Ag-P-N-CNTs 不仅能够通过强大的 Ag-S 键固定大量的 TSPs 形成 tracer label，而且与 Ag-P-N-CNTs 相比，电流响应提高了约 3 倍，说明 Fe-MOF能促进电子转移增强电化学信号响应以及 MOF/Ag-P-N-CNTs 纳米复合物能提高适体传感器的灵敏度。其次，通过亲和素-生物素相互作用力使 BCPs 与 SA 结合，可以增加所固定的捕获探针的数量和被识别目标物的数量，从而提高检测性能。最后，该适体传感器表现出了出色的重现性、稳定性、选择性和加标回收率，并且具有较宽的线性范围和较低的检测限。凭借这些优点，该 signal-on 夹心型适体传感器为 LPS 的痕量检测提供了一个新型电化学平台，并有望通过更改探针序列来检测更多的目标分析物。
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全文总结
1. 基于 Ag-TNT/P-rGO 纳米复合物建立了用于 LPS 痕量检测的 signal-off 型电化学适体传感器，该方法线性范围为 10 fg/mL~100 ng/mL，LOD 值为 5 fg/mL，批内和批间 RSD 分别约为 6.3%和 0.2%，在维生素 B1 注射剂样品中的平均回收率为 95.9%~102.7%，具有较好的重现性、稳定性和选择性。
2. 基于亲和素-生物素系统和 MOF/Ag-P-N-CNTs 纳米复合物为信号放大材料建立了 signal-on 夹心型电化学适体传感器并用于 LPS 的痕量检测，该方法具有出色的重现性、稳定性和选择性，在 1 fg/mL~100 ng/mL 范围内呈现优良的线性关系， LOD 值为 0.11 fg/mL，批内 RSD 约为 0.55%，批间 RSD 约为 0.95%，在维生素 C注射剂样品中的平均回收率为 95.5%~104.7%。
3. 本文构建的两种不同类型的用于 LPS 痕量检测的电化学适体传感器均展现了良好的检测结果。第一种 signal-off 型传感器直接检测目标分析物，构建过程相对较为简单，修饰步骤少，耗时较短。与第一种相比，第二种 signal-on 夹心型传感器虽然传感器构建步骤更繁琐，但该传感器的抗干扰能力增强，在一定程度上避免了假阳性的发生。
参考文献（略）