前 言
由于其涉及机制复杂，目前AD尚无有效的治疗方法，已成为威胁老年人群健康生存的主要疾病，给家庭乃至整个社会带来了沉重的负担。因此，加强对AD发病机制的研究和积极寻找有效的治疗方法具有重要的经济意义和社会意义。现公认Aβ沉积是AD发病的中心环节，其致神经元凋亡机制的研究一直是AD发病机制的研究热点。其中线粒体功能障碍是AD发病过程中Aβ导致神经元毒性的重要标志[4]，近年来关于Aβ沉积引起的神经细胞线粒体在膜电位和膜通透性、能量代谢、释放促凋亡因子、氧化应激与钙稳态等的改变所导致的神经细胞损伤和神经毒性已成为新的研究热点。
一、β淀粉样蛋白神经毒性与线粒体功能异常研究
1. Aβ 的形成与其神经毒性
Aβ 由 β-淀粉样蛋白前体（β-APP）水解产生，APP 有两条代谢途径：一是被 α分泌酶水解，再经 γ 分泌酶切割水解得到可溶性分泌型 APP（sAPP），称为非淀粉样物质途径；二是极少部分的 APP 在胞质溶酶体经 β 和 γ 分泌酶切割水解得到不溶性的Aβ 碎片，称为淀粉样物质途径。正常情况下，Aβ 的产生和降解平衡；病理条件下，进入两种途径的 APP 比例失调，Aβ 的产生量可达正常情况下的 4-10 倍。神经元细胞内的 Aβ 主要来源可分为外源性和内源性，即一是细胞可以将分泌到胞外的 Aβ 重吸收到细胞内；二是细胞内自身产生的 Aβ，这可能是由于 APP 和 β 分泌酶、γ分泌酶共存于内涵体、内质网和高尔基体中，从而 APP 被剪切生成了 Aβ[5-7]。
最近研究表明 Aβ 从细胞内特别是在内质网和高尔基体中产生后，会逐渐在这些部位积累并引起线粒体结构和功能障碍，损伤细胞功能，接着随细胞裂解释放到胞外，逐渐形成老年斑[9]。这种观点现已被广泛认同，而且根据神经退行性疾病发病早期曾出现能量代谢障碍的临床报道，线粒体极有可能参与了此过程并扮演了重要的角色。
二、染料木素研究概况
染料木素(Genistein)又称金雀异黄酮、染料木黄酮，主要为豆科植物中提取出来的活性成分，是大豆异黄酮苷元的主要活性成分之一。由于其具有与雌激素相似的结构，能竞争性结合雌激素受体，从而发挥雌激素样作用，广泛应用于制药及保健品等领域[26-27]。染料木素外观为淡黄色树枝状针晶粉末，熔点 297℃-298℃；具强疏水性，几乎不溶于水，而易溶于二甲基亚砜，在甲醇、乙醇中有一定的溶解度[28]，因其结构中含有羟基而显弱酸性，溶于稀碱中呈黄色。
近年来研究显示，雌激素是一种中枢神经保护剂，具有抗神经退行性疾病的作用[29]，可有效预防阿尔茨海默病( Alzheimer disease，AD) 或帕金森氏病。在抗 AD 相关药物筛选中，发现了多个异黄酮衍生物在体外具有显著的胆碱酯酶抑制活性，而且对于 Cu2+导致 APPsw-SY5Y 细胞损伤还具有明显的保护作用。此外，在学习记忆行为学实验中，其可显著改善东莨菪碱导致的获得性学习记忆障碍。Yang等[30-31]研究发现 Gen 可通过下调 β-分泌酶活性，减少 Aβ 的聚集，使 Aβ 诱导的神经细胞毒性降低，而且 Gen 也可通过降低丙二醛（MDA）的含量，提高谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）活力和血清中超氧化物歧化酶（SOD）活力，改善神经细胞形态，对改善衰老 AD 小鼠的学习记忆能力和抗氧化能力十分有效。
近年来研究发现染料木素具有抗肿瘤作用，对前列腺癌、白血病、乳腺癌、皮肤癌、大肠癌、肝癌、肺癌等癌细胞生成与增殖具有抑制作用。Sharon A．等[32]对人类乳腺癌细胞进行了研究，结果发现转移的蔓延是乳腺癌转移的主要原因，术后用含有染料木素的饮食喂养可以减少常位乳腺癌模型转移，抑制细胞增殖，促进癌细胞的凋亡。Li M. 等[33]研究显示，染料木素能下调鼠双微基因2（MDM2）癌蛋白的表达，同时上调p53表达。在敲除p53基因后，染料木素同样能下调MDM2的表达，并可上调另一基因P21（p53靶基因）的表达，发挥抗肿瘤作用。Pavese等[34]研究表明染料木素可通过影响细胞周期从而改变细胞增殖和凋亡，降低Atk及NF-ΚB通路的活性，此外，还可改变细胞黏附，降低细胞迁移速率及细胞金属蛋白酶的表达。染料木素抗肿瘤作用机制尚未清楚，可能通过抑制细胞周期，上调相应促凋亡基因，下调相应抗凋亡基因，促进肿瘤细胞凋亡，从而起抗肿瘤作用。
染料木素具有多羟基酚的结构，体内外实验显示它可与自由基反应形成离子或分子，使氧自由基导致的 DNA、蛋白质氧化损伤和脂质过氧化降低，发挥一定的抗氧化活性，而且大量研究表明其还能提高体内抗氧化酶活性，有 SOD 样作用。HuachenWei 等[35]研究显示染料木素植入 DNA 中，可使 DNA 结构的完整性改变，抑制氧化物质的产生，以及减少由紫外辐射导致的 8-OHdG 的生成，从而发挥抗氧化作用。Trieu等[36]研究用光活化剂诱导小鼠大脑突发损伤前 6h 至损伤后 24h，给予 16mg/kg 的染料木素，可明显减轻脑损伤程度，结果表明染料木素可对抗活性氧自由基造成的大脑损伤，起抗氧化作用。
第一章 染料木素对 PC12 细胞线粒体形态及活力的影响研究
内膜向线粒体腔内突出皱褶形成嵴，它在完成线粒体的功能中起重要作用。线粒体的这些结构上分布着百种以上已确认的酶类，如外膜中含有合成线粒体脂类的酶类，内膜中含有执行呼吸链氧化反应的酶系和ATP合成酶系；基质中有高浓度的多种酶的混合物[46-47]。而线粒体的重要功能之一就是通过位于内膜的呼吸链参加三羧酸循环中的氧化反应，进行电子传递，并通过氧化磷酸化作用进行能量转换，将摄取的糖、蛋白质、脂肪等营养物质转换为化学能，生成能源物质ATP，不断供给细胞生理活动的需要。因此，线粒体结构和功能的异常必然会通过细胞能量代谢等生理功能的变化导致有关病变。近年的研究发现，线粒体的功能与细胞凋亡密切相关。
第一节 不同浓度 Gen 对 Aβ 诱导损伤的 PC12 细胞活力的影响
2.1 细胞复苏
将细胞从-80℃冰箱中取出，迅速置于 37℃水浴锅中，不断摇动令其快速融化后，将冻存的细胞液吸入无菌离心管，1000rpm 离心 5min，弃上清，重悬于高糖 DMEM培养基中，置于 37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱中培养，次日换液。
2. 2 细胞传代培养
将 25cm PC12 细胞瓶（贴壁率达 80%），弃掉原培养基，用 PBS 液洗一遍，加入0.25%胰蛋白酶 2ml 轻晃流经细胞表面，30s 左右（显微镜下观察细胞突起收缩，间隙变大），吸去消化液；加入 2ml 完全培养基终止消化；吹打成单个细胞。吸取少量细胞悬液，用细胞计数板计数，依稀释比例接种于新的细胞培养瓶中，置 CO2恒温箱中继续培养，3-4d 传代一次。
第二节 染料木素对 PC12 细胞线粒体形态及活力的影响
线粒体是细胞内非常重要的细胞器，在细胞的整个生命活动中起着非常关键的作用。线粒体由内外两层脂质双分子膜围合而成的细胞器，其往往富集于细胞中需要大量能量的位置或者在突触结等代谢功能很重要的位置，与其功能有关的上千种生物大分子，包括蛋白，酶，核酸等都分别装配或分布于不同的空间内[49-51]。因此，线粒体不仅为细胞提供能量，而且还与细胞中氧自由基的生成、细胞程序性死亡、细胞信号转导、细胞内多种离子的跨膜转运及电解质稳态平衡的调控等有关。
Mito-Tracker Green是一种线粒体绿色荧光探针，可用于活细胞线粒体特异性荧光染色，其与rhodamine 123或JC-1相比，Mito-Tracker Green对于线粒体的染色不依赖于线粒体膜电位。本实验结果表明，Aβ25-35组细胞线粒体的形态发生明显改变，线粒体数目减小，而Gen各组荧光增强，细胞线粒体大小均匀、清晰，形态正常。琥珀酸脱氢酶（Succinatedehydrogenase，简称 SDH），黄素酶类，是线粒体内膜的标志酶，参与三磷酸循环与组成电子传递链的枢纽之一，可为真核细胞线粒体和多种原核细胞需氧和产能的呼吸链提供电子[52-54]，其活力大小是三羧酸循环运行的评价指标。Fattoretti 等[55]研究 Aβ 诱导的线粒体功能障碍时发现，Aβ 还可通过抑制琥珀酸脱氢酶(succinic dehydrogenase，SDH)的活性使神经元 ATP 水平下降，诱发神经细胞凋亡。
但 Gen 能否通过保护线粒体、抑制 AD 的神经元细胞凋亡等途径，进而阻止 AD的进展，发挥其神经保护作用，目前报道较少。故本试验依据氧化应激在 AD 的发病中的作用进一步研究 Gen 对 Aβ诱导的神经毒性是否具保护作用。本实验采用经过由Aβ25-35处理过的己分化的大鼠嗜铬细胞瘤 PC12 细胞，观察 Gen 对 PC12 细胞氧化应激指标活性氧(ROS)、丙二醛(MAD)含量和超氧化物岐化酶(SOD)活性的影响，为推广Gen 的临床应用领域提供理论依据。
此外，线粒体的自由基代谢水平或者说是呼吸链的电子漏程度与机体生理状态密切相关。衰老、疲劳、疾病可导致SOD活性降低，自由基代谢水平增高。如机体衰老时，线粒体内的自由基大量增加，一方面是由于老年时电子传递链功能降低，CoQ部位聚集的电子增多，导致电子漏流增加，氧自由基产生增多，另一方面衰老细胞线粒体内SOD活性降低、对自由基清除能力下降[64]。AD是衰老相关疾病，虽然其发病机制十分复杂，可能与遗传因素、环境因素等有关。但最近的研究表明线粒体的结构和功能异常、自由基产生增多和氧化应激损伤在引起AD发生的环境因素中起重要作用。因此氧自由基可能在AD的发病过程中起中间“桥梁”作用。Aβ的神经毒性作用主要通过破坏了线粒体内正常的SOD酶系统，导致氧自由基累及增多，线粒体膜等生物膜受到氧化损伤的影响，神经元的氧化磷酸化水平降低，进而又加重了氧自由基的产生，如此恶性循环促使AD的发生。
第二章 染料木素对 PC12 细胞自由基清除及氧化应激的影响研究 ............. 24
1 实验材料和仪器 ..................................................... 24
2.实验分组 ........................................................... 26
3.PC12 细胞活性氧的测定 ............................................. 26
4.PC12 细胞丙二醛的测定 ............................................ 26
第三章 染料木素对 PC12 细胞膜电位及膜通透性的影响研究 ................ 34
1 实验材料和仪器 .................................................... 34
2.实验分组 .......................................................... 36
3. PC12 细胞膜电位的测定 ............................................. 36
4. PC12 细胞细胞色素 C 检测 ...................................... 36
小结 ............................................................... 45
第三章 染料木素对 PC12 细胞膜电位及膜通透性的影响研究
原理：采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被 PC12 细胞捕获抗原的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP 标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物 TMB 显色，TMB 在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的细胞色素 C 呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），通过标准曲线计算样品中细胞色素 C 浓度。
细胞色素C（Cyt C）是哺乳动物细胞凋亡信号转导过程的关键因素，正常情况下Cyt C位于线粒体内外膜之间，凋亡刺激物可引起Cyt C从线粒体易位释放入胞浆。而细胞色素C（Cyt C）释放是Caspase-3激活的促发因素，是线粒体途径细胞凋亡的关键环节。研究显示[72-73]，线粒体膜通透性运动孔（permeability transition pore， MPTP）开放，线粒体跨膜电位降低或丧失，是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件，而一旦线粒体跨膜电位耗散，细胞就会进入不可逆的凋亡过程，如果能稳定线粒体膜电位就能防止细胞凋亡或可阻止凋亡的进展。进一步研究证实[74-76]，MPTP 开放，Cyt C等效应因子从线粒体膜间腔释放至细胞质，导致细胞通过两条路径死亡，一是进入慢速坏死过程，线粒体由于高渗而膨胀，至使外膜破裂、跨膜电位快速崩溃、Cyt C大量释放、电子传递链受阻、活性氧剧增、ATP产量骤减，无法维持供能，细胞走向死亡；二是通过快速凋亡途径，Cyt C可与Apaf-1(apoptotic protease activating factor-1)结合，在ATP/dATP的介导下，使caspase-9前体裂解为活化的caspase-9，活化的caspase-9再激活caspase-3，活化的Caspase-3作用于胞质中的细胞骨架蛋白，或作用于细胞核中的DNA酶，引起DNA断裂，从而引发凋亡[77-78]。因此，Caspase-3是细胞凋亡的主要执行者，被称为细胞凋亡的“终结者”。
本文研究显示染料木素能稳定Aβ诱导损伤的PC12细胞线粒体跨膜电位，减少CytC的释放，抑制Caspase-3活性，降低Aβ诱导的细胞损伤程度，从而抑制细胞凋亡，发挥神经保护作用。其具体机制有待进一步深入研究。
总结与展望
染料木素作为大豆异黄酮苷的主要活性成分，对中枢神经系统具有显著的保护作用，目前，已有大量的研究报道证实了这一保护作用。但由于其作用机制非常复杂，国内外报道较少，尤其对有关线粒体介导的神经细胞凋亡信号转导通路报道较少。因此研究其确切的作用机制成为摆在所有科研工作者面前的艰巨任务。本论文以 Aβ 的形成和沉积为靶点，并在本课题的前期研究基础上，采用 Aβ25-35建立 PC12 细胞损伤模型，研究染料木素对细胞损伤的保护作用，并较系统研究染料木素通过影响线粒体形态和功能、氧化应激以及线粒体膜通透性和膜电位，从而发挥保护作用，阐明染料木素抑制 Aβ 细胞损伤的保护作用的分子机制，为染料木素用于 AD 治疗提供了科学依据。
本论文的研究结果总结如下：
1. 成功建立了 Aβ 诱导的 PC12 细胞损伤模型，该模型稳定、可靠。20μmol/L 的 Aβ25-35作用于 PC12 细胞 24h 后，可造成细胞形态损伤并降低细胞存活力。
2. 通过 MTT 细胞活力检测，筛选出 Gen 起保护作用的的最佳浓度为 25μmol/L，高浓度的Gen存在细胞毒性，结果表示Gen在一定浓度范围内对Aβ诱导损伤的PC12细胞具有保护作用。因此，选用 Gen 的浓度为 0、12.5、25、50μmol/L，用于后续实验研究。
近年来，染料木素对 AD 的保护作用得到了广泛的关注。AD 发病机制非常复杂，临床上缺乏有效的治疗药物。线粒体在神经退行性疾病发病早期的作用不可忽视。深入研究线粒体功能，探讨其在神经损伤过程中的生理变化，既有利于深入理解神经退行性疾病的发病机制，也有利于寻找和发现新的治疗药物。本论文通过对染料木素关于细胞线粒体的保护作用及其可能的分子机制的进一步研究，为 AD 的诊断、临床治疗、新药研发等奠定了坚实的基础，具有十分重要的意义。
参考文献（略）