前言
一、心肌纤维化与内皮-间质转化（EndMT)
心肌纤维化(myocardial fibrosis, MF)是临床一种常见病，指在心肌的组织结构中胶原纤维过量积聚、其胶原浓度显著升高或胶原容积分数(CVF)显著增加。心肌纤维化是在现代医学研究基础上提出的病理名称，在许多心脏病如：高血压性心肌肥厚、冠心病心梗后的心肌重塑、糖尿病性心脏病、限制型心肌病、扩张型心肌病、风湿性心脏病、先天性心脏病等均存在不同程度的心肌纤维化。根据其特性，中医学可将心肌纤维化归属于“胸搏”范畴，病情发展可逐步导致“心悸”、“喘证”、“水肿”等。
心肌纤维化的发展过程中都会伴随心肌间质网络的重构，纤维化与心室重构的并存将使心脏的舒张功能、收缩功能严重受损，对心脏产生显著的负面影响，最终导致难治性充血性心力衰竭。心肌纤维化的起点是各种原因所致的心脏实质细胞（心肌细胞）的变性、坏死、调亡或仅仅是亚细胞结构或生化、代谢方面的改变，继而激活相应的巨唾细胞及其它细胞，产生和释放多种活性因子(细胞因子、生长因子等)，进而激活心肌组织中的细胞外基质(extracellular matrix, ECM)生成细胞，生成心肌ECM的细胞为各种心肌间质细胞。心肌纤维化涉及各种各样的原始病因，其调控机制受诸多因素影响，形成机制非常复杂，近年来内皮一间质细胞转化（endothelial-mesenchymal transition, EndMT) 越来越受到广大学者的关注，在心肌纤维化过程中发挥着关键作用。EndMT是上皮--间质转化的一种形式，通过内皮细胞的分解、改变表型、迁移到周围组织中，其特征是内皮细胞标志CD31、VE-cadherin的丢失和问质细胞标志SMA、vimentin的上调，以及procollagen I和FSP1的上调。
在正常情况下，EndMT存在于胚胎时期心脏的形成阶段，通过内皮--间质转化，心内膜形成了心间质细胞，而后进一步形成了成人心脏的房室塾、原始瓣膜和心隔，而这一过程受TGFP和BMPs的调控现代研究表明，心肌纤维化过程中EndMT起着很重要的作用。在体外，主动脉内皮细胞经TGFpi的诱导，可转化成(X-SMA表达阳性的间质细胞，而且这种转化在TGFβ1作用10天内是可逆的，而在20天后，这种作用即表现为不可逆[12]。在体内，正常组织，并没有内皮细胞和a-SMA阳性细胞的共区域化，而在纤维化后，有一定比例的细胞表达内皮标志和a-SMA双阳性，表明有些内皮细胞经历了从内皮向间质表型转变的过程[13]。
二、心肌纤维化细胞模型与EndMT
在现有的心肌纤维化细胞模型中，有以下几种方法：①活化后的TGFβ1是心肌纤维化的关键细胞因子，是诸多因素导致心肌纤维化的最后共同中介物之一。TGFβ1诱导心朋：组织成纤维化细胞的增殖，TGFβ1在lOng/mL-30ng/mL可刺激成纤维化细胞的增殖，并呈一定的浓度依赖性，作用24h后，细胞活性和轻脯氨酸的含量明显升高；②根据肾素一血管紧张素系统（RAS)是心肌纤维化的重要体液因素，因此用Ang n刺激成纤维细胞的增殖。Ang II (lOVol/L)与成纤维细胞共培养24h后，细胞增殖明显活跃；③基于肾素-血管紧张素系统-醛固酮系统（RAAS)在心肌纤维化中的重要作用，用酸固酮刺激成纤维细胞的增殖。
这三个模型都能促进心脏成纤维细胞的增殖，I、III胶原分泌的增加，有着共同的特点：①都是针对心肌纤维化的一个主要的特征--心肌成纤维细胞的异常增殖；②都是关注本地成纤维细胞的增殖，用来研究抑制其增殖及影响增殖后下游通路的变化；③这些模型都没能回答心肌成纤维细胞的来源问题。而本课题根据内皮一间质细胞转化，利用TGF-P诱导冠状动脉内皮细胞向间质细胞转化，并进一步增殖，这一模型试图回答了心肌纤维化中最初成纤维细胞的来源和后期增殖这两个问题。
瓜蒌薤白白酒汤，由瓜蒌(12g)、薤白(12g)和白酒(适量)3味中药组成，具通阳散结、行气祛痰之功效。此方出自张仲景《金匮要略》，“胸瘦之病，喘息咳唾，胸背痛，短气，寸口脉沉而迟,关上小紧数，括蒌薤白白酒汤主之”，是中医治疗胸瘦的著名方剂。近年来多用于治疗冠心病、心绞痛、支气管哮端、肺纤维化等心肺疾病。以该方为基本方，随症加减，对治疗心血管确有良效，如瓜蒌薤白半夏汤、枳实薤白桂枝汤等。
该方的传统功效是治疗“胸痹”，现代包括高血压性心肌肥厚、冠心病心梗后的心肌重塑、糖尿病性心脏病、限制型心肌病、扩张型心肌病、风湿性心脏病、先天性心脏病、心肌纤维化等心脏疾病都属于“胸痹”范畴，归于瓜蒌薤白白酒汤的适应症，而且这些心脏疾病均不同程度的伴随着心肌纤维化。本课题旨在利用内皮-间质细胞转化，模拟临床人心肌纤维化的形成过程，构建一种全新的经济、简便的细胞模型，可以用于有关药物的蹄选和机理研究，发现针对这一途径的新药和新制剂。此模型优于现有模型中简单的剌激成纤维细胞增殖的模型，并能解决成纤维化细胞的来源和后期增殖问题；并在构建的细胞模型基础上，研究瓜蒌薤白白酒汤对内皮一间质转化的影响，并进一步发现对EndMT的作用机理，明确经方传统功效可能的作用途径和促进经方的进一步开发。
第一部分文献综述
第一章内皮一间质转化在纤维化中的作用
在心肌纤维化的发展过程中都会伴随心肌间质网络的重构，纤维化与心室重构的并存将使心脏的舒张功能、收缩功能严重受损，对心脏产生显著的负面影响，最终导致难治性充血性心力衰竭。心肌纤维化的起点是各种原因所致的心脏实质细胞(心肌细胞)的变性、坏死、调亡或仅仅是亚细胞结构或生化、代谢方面的改变，继而激活相应的巨嗟细胞及其它细胞，产生和释放多种活性因子(细胞因子、生长因子等)，进而激活心肌组织中的细胞外基质(extracellular matrix, ECM)生成细胞，生成心肌ECM的细胞为各种心肌间质细胞。
正常心脏间质包括：I、III型胶原，为主要结构蛋白；少量IV、V和VI型胶原，存在于细胞膜及细胞间隙；少量弹性蛋白；氧基多糖和与结构蛋白有关的糖蛋白；肾上腺素能神经末梢；血管和淋巴管；间充质的细胞，如：成纤维细胞、周细胞、血管间质细胞（vascularinterstitial cell, VIC)和巨喷细胞；组织液，是血浆的超滤液，还有产生于实质细胞、间充质细胞和神经末梢的信号物质，调节FBC和myoFb生长及行为。其中最重要的是I型和III型胶原，约占总胶原浓度的90%以上，是构成间质的主要成分，也是心脏僵硬度的决定因素。I型、III型胶原和其它胶原共同构成胶原纤维网络，将心肌细胞连成一体，直接影响i他们的收缩、舒张和完整组织中的形态。
内皮-间质细胞转化在心脏发育过程中起着重要的作用，在正常情况下，发生于胚胎时期心脏的形成阶段。心脏是哺乳动物最早发育的器官，人类在胚胎20天时形成原肠胚层，，其后中胚层前侧板的原始细胞在相邻内胚层的诱导信号作用下，形成心脏的原基[38]。心脏原基在中线处融合形成原始心管。心内膜垫的间质向外生长使心管分隔成心房、心室和流出道。当心内膜垫向外生长时，相互隔合形成心隔和瓣膜。心房和心室分成左右心腔是由心房或心室内的间隔分别完成的。另外心内膜垫向头侧和尾侧方向生长可分别生成心房和心室间隔。但是有关于心内膜的形成存在着争议。形成心内膜的细胞起源于心源性的脏壁中胚层和内胚层是不容置疑的，但是这些前心内膜细胞如何转变成心内膜细胞却不是很明确。一些研究者认为心内膜前体是来源于心脏形成区域自身，心内膜细胞在向前内胚层迁移过程中经历了从内皮细胞向间质细胞的转化；另有人认为这些细胞出现于中胚层的心脏形成区域的前部或后部[39]。但是内皮细胞的抗体标记JB3的出现，证明了这俩种起源是同时存在的，在原肠胚层早期的心前中胚层和心内膜可以表达JB3，而且JB3只在可以向心脏间质细胞转化的心内膜细胞上表达。通过内皮一间质转化，心内膜形成了心间质细胞，而后进一步形成了成人心脏的房室垫、原始瓣膜和心隔。通过各种信号组件缺失的转基因小鼠，证明了这一过程受心肌细胞分泌的TGFP和BMPs的调控。
虽然在移植培养中发现BMP能诱导EndMT[46]，但其基因证据局限于BMP多种成分中的一种缺失能引起早期小鼠死亡。在诱导小鼠房室塾形成中发生EndMT时内皮特异性标志的缺失完美地证明了BMP信号通路在这一过程是必需的。内皮组织中ALK2的缺失将会引起房室沟EndMT的障碍[56]，内皮组织中ALK3的特异性缺失表明ALK3在通过EndMT使得间质细胞形成心内膜塾过程中也是必需的[57]。小鼠胚胎心肌中BMP的特异性失活，抑制了心内膜垫的形成通过一个EndMT的2步法模型，证明心肌中ALK3表达缺失的同时TGFP2也不足[59]。分析双重突变胚胎的同源异形盒因子Msxl和Msx2，BMP信号通路的下游效应和上游调节作用，发现房室垫SMA阳性细胞数目的减少，表明EndMT发现了障碍。总之，在心脏发育过程中，TGFβ和BMP都是诱导EndMT所必需的。
第二章心肌纤维化细胞模型的应用一瓜蒌薤白白酒汤对心肌纤维化内皮-间质转化的作用......37
第一节瓜蒌薤白白酒汤对内皮-间质转化的作用.............38
第二节瓜蒌薤白白酒汤对内皮-间质转化TGF-B-Notch通路的作用.......45
第三章瓜蒌薤白白酒汤抑制内皮-间质转化的整体验证.............53
第一节瓜蒌薤白白酒汤对心肌纤维化大鼠的作用.............54
第二节瓜蒌薤白白酒汤抑制内皮一间质转化的体内机制研究.............76
结语......................................................82
第二部分实验研究
第一章基于内皮-间质细胞转化的心肌纤维化细胞模型的建立
上皮-间质转化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)是指上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程，是哺乳动物从胚胎到死亡过程中一个重要的生物进程。EMT的发现最早要追溯到19世纪20年代，由Johannes Holtfreter在胚胎的早期发育过程中发现，至60年代Elizabeth Hay正式将上皮细胞经历的这一表型改变命名为EMT,后继的一系列研究表明上皮-间质转化是可逆的，即也可发生间质--上皮转化。
经过前期实验发现，以冠状动脉内皮细胞为基础细胞，rhTGFpi为诱导剂，在10 ng/mL诱导剂作用下，经过7天，内皮细胞标志表达逐渐减少，间质细胞标志表达逐渐增加，内皮细胞转化为间质细胞，可成功构建心肌纤维化细胞模型。这一模型是否能很好的应用于心肌纤维化的研究，有力补充和丰富现有心肌纤维化细胞模型，需要实践的检验。由于现在临床上没有良好的公认的治疗心肌纤维化的药物，所以本课题选择具有一定研究基础的治疗“胸瘦”的传统中药复方--瓜蒌薤白白酒汤为新构建的心肌纤维化细胞模型的应用药物。在此，本课题将新构建的细胞模型应用于瓜蒌薤白白酒汤的抗心肌纤维化作用研究，探讨其作用机制和作用紀点，为丰富现有心肌纤维化研究思路和方法具有重要意义。
结语
一、论文主要结论
基于内皮-间质转化的心肌纤维化细胞模型，利用TGF-β1诱导冠状动脉内皮细胞向间质细胞转化，并进一步增殖，这一模型，回答了心肌纤维化中最初成纤维细胞的来源和后期增殖两个问题。
我们的研究表明：
(1)成功建立了基于内皮-间质细胞转化的心肌纤维化细胞新模型：以人冠状动脉内皮细胞为基础细胞，确定了诱导剂的类型，以及诱导剂的作用时间、作用剂量，并通过检测心肌纤维化相关指标进行了模型的鉴定。(2)心肌纤维化细胞模型的应用一从细胞水平观察瓜蒌薤白白酒汤对内皮-间质转化的影响：利用新构建的心肌纤维化细胞发现，瓜蒌薤白白酒汤正丁醇部位对正常的人冠状动脉内皮细胞的活力没有影响，但能明显抑制发生内皮-间质细胞转化过,中的冠状动脉内皮细胞的活力减弱（P<0.05-0.01)，对内皮细胞有一定的保护作用；流式iwestemblot检测发现，GXD对心肌纤维化细胞模型的EndMT有一定的调控作用，上调内皮标志蛋白CD31的表达，下调间质标志蛋白a-SMA/FSPl的表达，从而达到通过抑制EndMT行抗心肌纤维化之效。
(3)心肌纤维化细胞模型的应用一从分子水平观察瓜蒌薤白白酒汤对内皮-间质转化的影响：通过新构建的心肌纤维化细胞模型，结果显示，瓜蒌薤白白酒汤正丁醇部位组可明显上调Northl、Jaggedl、DLLl、DLL2表达（P<0.05-0.01)，下调Smad2、Smad3,而达到抑制EndMT。说明瓜蒌薤白白酒汤通过Notch通路抑制TGF-p通路而实现保护内皮细胞，阻断EndMT，抑制心肌纤纤维化。
二、论文创新点
心肌纤维化整体模型动物周期长，且心肌纤维化的发生机制有多方面，而中医中药研究多数仅仅限于抑制胶原合成，促进胶原降解。构建一种新的心肌纤维化细胞模型，有助于从细胞因子、信号传导等多角度进一步加强中药及其复方对心肌纤维化理方面的探讨，并缩短研究周期。
综上研究，基于内皮-间质转化的心肌纤维化细胞模型可模拟心肌纤维化的疾病发生发展过程，同时更具成本低、简单、高效、化合物用量少的优势：与整体动物实验相比，干扰因素少，条件便于控制，研究结果重复性好，且便于进行基因转染等研究，克服动物实验成本高、劳动强度大等缺陷，同时大大降低化合物的用量；与其他细胞模型相比，基于内皮-间质转化的心肌纤维化细胞模型优于现有模型中简单刺激成纤维细胞的增殖，从根本上解决成纤维细胞的来源和后期增殖问题。基于内皮-间质转化的心肌纤维化细胞模型是一种新的细胞模型，有力补充、丰富现有心肌纤维化模型，有利于实现抗心肌纤维化药物特别是量微成分的快速蹄选，有利于研究相关药物抗心肌纤维化的作用机理，缩短研究周期，成为极具前景的心肌纤维化细胞新模型。
三、对后续研究的展望
本论文的相关研宄工作是在博士研究生期间学习和工作的阶段性结果，是在思考和探索中取得的相关研宄进展，如预进一步发挥该模型的作用，还需要大量深入细致的系统研究工作。
(1)围绕新构建的心肌纤维化细胞模型的可行性与合理性，拟再选择适宜的中药或中药成分，展开继续深入研究。
(2)围绕新构建的心肌纤维化细胞模型的标准化，建立该模型的相关标准、指南，为该模型成为公认的、规范化的细胞模型奠定基础。
(3)围绕新构建的心肌纤维化细胞模型的应用价值，将其与现代色谱技术、药效蹄选技术及分子生物技术等稱合，用于中药物质基础、作用机制的快速发现。
参考文献（略）