第一章绪论
1.1引言
药物创新不单是国家的重大战略，而且也是人类维护自身健康的重要途径，众所周知，创新药物的研发是一个漫长且高淘汰的过程。制约创新药物研发整个过程的瓶颈是活性成分的蹄选，而活性成分发现的重要手段就是通过药物蹄选模型。因此，建立一种周期短，成功率高的药物蹄选模型就成为至关重要的环节。在长久而艰难的新药寻找过程中，根据实践经验建立了各种模型用来蹄选药物，可以说药物发展史与药物蹄选模型的发展史同步。本章内容在简要介绍了药物筛选模型的分类、发展进程以及在药物筛选中的应用的基础上，综述了蛋白质固定化方法结合亲和色谱的筛选药物的理论模型以及斑马鱼作为新生整体动物模型在药物蹄选过程中优势以及研究状况，同时就本论文的研究内容做以简单概括。
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1.2国内外新药蹄选模型的研究现状
新药筛选模型(drug screening model)，既是一种用于证明某些化合物以及中药具有.药理活性的实验方法⑴，又叫高通量筛选模型。是以整体动物模型、建立在细胞、分子7K平上的细胞模型、受体模型以及能够蹄选中药复杂体系中有效成分的受体色谱模型。一般而言，创新药物的研究分为传统思路好和反向思路，传统思路从整体动物模型出发，通过药理活性评价，体外试验，和体内实验而进行活性成分蹄选，临床研究，而反向思路包括分子水平和细胞水平，高通量筛选活性成分，经过临床研究，获得创新药物。随着生命科学以及相关科学的发展，简便、快速、高效的药物蹄选模型不断出现，这就极大的促进了创新药物的发现，也对药物蹄选的方法、理论、技术产生了深远的影响。
1.2.1细胞、分子水平筛选模型
1)细胞模型：细胞模型是模拟药物与靴细胞之间的相互作用，具有与生理水平相接近的优势，将候选化合物与靴细胞相互作用，通过相应的检测技术检测结合能力，从而蹄选出具有潜力的化合物。这种方式较为适合蛋白质等具有复杂标祀的研究[2-3]。随着细胞生物学、基因工程的进展使更多的细胞包括正常细胞、转基因细胞、病理细胞等应用于药物蹄选试验中[1]。次外细胞蹄选也可以用于化学药物及中药的毒理研究[5]。作为目前应用较为广泛的Caco-2细胞体外吸收模型，该细胞系来源于人体结肠癌细胞，最初由Borchardt等[7]人在1989提出，国内外有人已将该细胞模型应用于天然药物研究，并观查某种成分的药理活性及胃肠道毒性反应[8]。为了克服该模型周期长的问题，Sevin等[9]通过优化方案将Caco-2细胞传统培养周期（21-25天）的时间缩短到6天。Horio和Pastan[ia_最早构建了 MDCK-MDR1细胞系，Cheng-Yue Zhang等[12]人是用MDCK-MDR1细胞模型研究了芳香幵穷药物对血脑屏障的作用，结果表明中草药中的芳香剂通过抑制皮糖蛋白而增加药物透过血脑屏障。陈秋等[13]人使用高胰岛素诱导培养HepG2细胞，建胰岛素抵抗细胞模型。表明啦格列酮明显增加胰岛素抵抗(Insulinresistance, IR)细胞模型的葡萄糖消耗。
细胞模型可以保持结构和功能的完整，在此基础上，用来检测候选化合物对细胞形态、毒性、代谢、信号转导和凋亡等的影响。随着中医药事业的发展，中药有效成分成为开发新药的一大途径，细胞模型也可为中药蹄选提供完整的生物系统，尤其适用于中药单味和复方药理活性研究。细胞模型在应用中的主要问题有细胞毒性、细胞生长及的粘连性。虽然大多数的化合物往往都能溶解于二甲亚砜中，但由于细胞对二甲亚砜又呈现出耐受性，这也就限制了蹄选化合物的最大浓度[14]。
2)分子筛选模型：随着生物学技术以及细胞生物学的发展，分子药理学也有了较为深入的了解，这为药物筛选提供了更多的靴点，如受体、酶等。分子筛选模型的最大优势是能够直接获得药物的作用机理信息王续等[17]人以流感病毒RNA聚合酶为IE点建立了抗流感药物蹄选模型，并且用四种已知抗流感药物验证此模型，结果显示，该模型能够用于高通量蹄选。张明等人以DNA回旋酶B亚基作为靴点建立了抗结核病药物筛选模型，并筛选出可能具有活性的两个候选化合物。陈立敏等[19]人为了蹄选有关雌激素受体yff亚型新结构类型的激动剂，建立了以ERE （雌激素应答序列）作为特异性勒序列结合基因检测和细胞转录诱导机制模型。
1.2.2整体动物模型
用整体动物模型来筛选药物长期以来一直倍受重视，整体动物模型包括正常组和病理组模型。从新药筛选方面看，整体动物模型能够从整体水平出发,系统地反应出药物具有的治疗作用，不良反应和毒副作用。由整体动物模型蹄选获得样品，对其临床价值和应用前景具有十分重要的指导意义。
在医学发展史中，当人们发现动物的某些生理、病理反应与人的有某些特征相似时，就开始使用动物来进行科学研究[20]。同时在十八世纪初，英、法等国家相继报道了一些动物生理指标[21]。二十世纪末日本国东京都医院田代真一提出了 “血清药理学”的概念后[22]，我国也相继展开了这方面的研究工作，并且取得了卓越的成就。王孝路等[23]人采用胆固醇饲养兔子和鹤子形成动脉粥样模型，在给予四种治疗药物三颗针、肉桂酸钠、苯乙肼和中药复方二仙合剂，结果表明二仙合剂和肉桂酸钠治疗粥样硬化疗效更优。姚裕家等[24]人釆用新生猪作为模型，将其一侧颈动脉结扎，放在8%氧气和92%氮气的环境下，制造缺氧缺血性(HIE)模型，观察超氧化歧化酶(SOD)的变化，和不同剂量地塞米松对脑缺氧缺血组织脂质过氧化物(LPO)、超氧化歧化酶(SOD)含量及病理改变。艾静等[25]人通过给Wistar大鼠灌注脂肪乳，并通过腹腔注射四氧啼唆建立了伴有胰岛素抵抗的2型糖尿病动物模型。Volker Alt等[26]人通过在大鼠的腔骨植入感染组织，进一步通过焚光原位杂交(FISH)技术检测细菌是否在腔骨感染。孙惠惠[27]建立A/Califomia/7/2009 H1N1小鼠动物模型。对感染小鼠进行病毒学、分子生物学、病理学考察，结果发现在感染后的第3-5天是病毒复制的高峰期，此后病毒复制减缓。在此基础上，通过感染之后小鼠的存活率、存活天数、肺部病理改变来评价板蓝根对于甲型流感病毒感的治疗作用。但由于正常组模型不能完全反应药物在病理状态下的治疗作用，而理想的整体动物模型应具有的基本因素是病理的稳定性、发病机制与人类病因的相似性、以及药物作用的可观察性。因此，在药物蹄选中建立更多的整体动物病理模型,已成为药物研究领域一重大课题。
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第二章定向固定化受体色谱筛药模型的建立
亲和标签，如一个糖残基，生物素，组氨酸，或半胱氣酸，一般被设计在蛋白质序列中某一个特殊位置，这样可以获得一种蛋白使其定向固定在固体表面上，这些固定相包括聚合物，金属，或二氧化鞋等。定向固定化是通过创建这些具有亲和性的标签和固体材料表面的活性基团之间的作用来实现的[62_65]。之前有文献报道，可以使用的重氮偶合方法以共价键方式将蛋白质键合到氨基苯基三甲氧基桂烧表面形成自组装单层膜上["“]。使用组氨酸标记的馬-肾上腺素受体（yfe-AR)作为探针，在这里我们通过重氮盐和组氨酸之间的特异性共价键反应创新性的将蛋白质定向固定化到大孔桂胶的表面形成亲和色谱。在此基础上，我们应用该y92-肾上腺素受体色谱柱来蹄选中药麻黄。
2.1仪器与材料
2.1.1仪器
本章所用仪器较多，其名称、规格和主要信息如表1所示。
2.1.2材料
10mM磷酸盐缓冲溶液，盐酸麻黄碱（中国生物药品检验所），盐酸伪麻黄碱（中国生物药品检验所)，其他化学试剂均为分析纯。
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2.2 β2-AR的提取
2.2.β2-肾上腺素受体的诱导表达取重组菌E.Coli BL21 (DE3)pET32-a/β2-AR,解冻后，以1 %的接种量在37 °C, 220rpm情况下一级培养12 h,培养基条件为：每1 L培养液中含有5.0 g酵母提取物，10.0g蛋白胨和10.0gNaCl。然后以8%的接种量将一级培养菌种接至850 mL发酵培养基中，37 V, 220 rpm下培养，培养基条件为：每化培养液中含有10.0 g酵母提取物，1.35 gNH4CI, 2.0gNaH2P04, 5.0gNa2HP04, 1.0 gMgS(V7H20 和 51.0 g 葡萄糖，并加入空白对照，间隔半小时测量OD600值，当溶液的OD600值为0.4-0.6时，加入使终浓度为2.0 mmol/L的IPTG诱导目的蛋白，将温度降至32 °C，220 rpm下继续培养5 h。
将培养的发酵液在低温冷冻离心机中以4000 rpm，4°C下离心15min，取出沉淀并称重。以1 g: 10mL比例向沉淀中加入lOmmol/L磷酸盐缓冲液，搅拌均勾在冰浴条件下进行超声破碎（超声10 s,间隔15 s，超声4次，功率为400瓦）。将破碎后的菌液于11000rpm低温冷冻离心30min，取出上清液，-20°C下保存待用。2.2.2蛋白质的纯化
1) Ni2+离子柱（Ni2+ Sepharose 6 Fast Flow)初步分离β2-AR
固定化金属离子亲和层析(IMAC)利用了交互螯合的过渡金属离子和侧链蛋白质含有的某些氨基酸之间（主要是组氨酸）的反应来完成分离纯化。在一般情况下，nP离子柱是含有组氦酸标签的蛋白质纯化的优选方法。镇离子柱的媒介包括90 高度交联的琼脂糖，其中含有一个賴合的螯合基团。这螯合基含有镍离子。同时镍离子柱具有高蛋白结合能力。由于在β2-AR的N以及C末端都加上了 His-tag标签，利用His-tag与Ni2+金属具有较强的特异性吸附，因此可用Ni2+Sepharose6FastFlow进行蛋白质的分离纯。
取使用IPTG诱导后的菌体上清液，过0.45μm水系膜，利用AKTA低压层析仪，色谱柱为Ni2+Sepharose 6 Fast Flow螯合柱(填料为5 mL),紫外吸收波长为280 rnn。在使用柱子和系统之前，应先用纯水将系统和柱子中的乙醇冲洗完全。在Ni2+纯化中需要是用两种流动相，A 液(20 mmol/LPBS, 500 mmol/LNaa，pH=7.4)和 B 液(20 mmol/LPBS, 500 mmol/LNaCL 500 mmol/L咪唾，pH=7.4),在使用纯水冲洗系统后，使用B液冲洗至电导平稳，然后用A液平衡柱子至紫外基线以及电导基线平稳后，使用A粟(也就是A液泵)上样。流速为1.5 mL/min。上样结束后继续是用A液冲至紫外极基线不在变化，然后改为梯度洗脱，首先使用10%的B液洗脱，直到收集到峰1，在变为50%B液洗脱收集峰2,最后为100%B液洗脱，记录所得色谱图1，分离结束后将色谱柱保存在20%乙醇。
2)阴离子交换柱(Quaternary Sepharose Fast Flow)纯化β2-AR
阴离子交换柱(Quaternary Sepharose Fast Flow)是一种适合于各种等电点蛋白的高容量强离子交换柱。在PH2-12之间，季胺离子交换基团在整个分离纯化过程中一直处在充电和高容量的状态。根据动物体中β2-AR的等电点偏酸性，所以我们选择使用阴离子交换柱来对β2-AR进行下一步纯化。考虑到分离效果，我们选择使用缓冲液pH值高于等电点一个审位以上，所以选择的磷酸盐缓冲液pH为7.4。
在使用阴离子柱分离纯化蛋白质中需要用到的流动相为A'液(20 mmol/L PBS,pH=7.4)和 B'液(20 mmol/L PBS，800 mmol/LNaCl, pH=7.4)。首先使用纯水冲洗系统和柱子，电导平稳后换为B'液冲洗系统至电导稳定，在换为A'液冲洗，同样至电导平稳，最后使用18% B'液冲洗。取步骤1中Ni2+离子柱分离出的峰2，上样前，为了使样品能够吸附到阴离子柱上，必须将峰使用A'液稀释4-5倍，以使样品的电导小于18% B'液的电导。流速为5 mL/min,紫外吸收波长280mm，柱压不高于0.5MPa。当上样结束后，使用18%B'液继续冲洗直到紫外基线平稳，设置为梯度洗脱，条件为18%B'-100%B',洗脱40min，得图2，在洗脱过程会出现3个峰，峰2为我们的目的峰，收集样品待用。最后分别使用纯水和20%甲醇洗脱系统，将柱子和系统保存在20%甲醇溶液中。
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第三章麻黄碱和伪麻黄碱与β2-AR相互作用的研究.............................. 20
3.1仪器与材料......................................... 20
3.1.1 仪器....................................... 20
3.1.2 材料......................................... 20
3.2理论模型......................................... 20
3.2.1竞争置换法的理论基础......................................... 20
3.2.2热力学研究......................................... 21
3.2.3自身竞争置换法研究定向固定化β2-AR与盐酸麻黄碱的相互作用......................................... 22
3.2.4直接竞争置换法研究定向固定化β2-AR与盐酸伪麻黄碱的相互作用........................22
3.2.5热力学研究定向固定化β2-AR与盐酸伪麻黄碱和盐酸麻黄碱的相互作用............................22
3.3试验结果与讨论......................................... 22
3.4 小结......................................... 34
第四章斑马鱼模型
血管生成在生长以及发育方面拥有重要的角色，比如在创伤修复期、女性经期、胎儿成长发育期。然而在肿瘤生长方面，血管生成将会使肿瘤从休眠状态转变为恶性生长状态，这样就为侵袭其他组织的做好铺塾。而血管生成不足则有利于溃疡、中风和心绞痛等病的发生[80]。血管生成(Angiogenesis)是指从已有血管发芽生成新血管的过程。这一过程与血管内皮细胞迁移和增殖相关。众所周知，血管新生的机制牵涉到10个关键过程。血管新生刺激剂或阻断剂正是通过作用于其中一个或多个过程发挥其药理作用，这已成为新药研发的一个重要途径[81]。本研究以斑马鱼为模型动物，探讨IDHP混旋体对血管的保护作用，旨在为该药的临床前研究提供借鉴。
3.1仪器与材料
3.1.1仪器
本章所用仪器其名称、规格和主要信息如表15所示。
3.1.2材料
TG (VEGFR2： GFP)系血管突光转基因斑马鱼为山东省科学院生物研究所药物蹄选研究室提供；PTK787 （新型酪氨酸激酶抑制剂）由山东省科学院生物研究所生物化工研究室提供(批号：20110902)，经高效液相法测定纯度大于98,0%;丹参素异丙酯混旋体(IDHP，批号：20120502)由西北大学提供，使用液相色谱分析纯度为99.0%。
3.2实验方法
3.2.1斑马鱼胚胎获取
斑马鱼鱼房的条件为照明14 h/黑暗10 h交替进行，培养用水(含5.0 mM NaCl，0.17 mM KCl, 0.4 mM CaCh, 0.16 mM MgSOj)，水温保持在(28±1) °C，pH 值为(8.0±0.3)。将雌雄斑马鱼分幵喂养，定时给成年鱼喂以人工傅料，幼鱼给予刚孵出的齒虫无节幼体。需要卵时取健康性成熟的斑马鱼按雌雄1: 1或1: 2放入交配虹内，次日在鱼房条件为照明下抽取挡板，2小时后获得受精卵，对受精卵进行消毒和洗漆后移入含有培养水的鱼妃：内，28°C下在光照培养箱内培养24小时。
3.2.2 PTK787制作损伤模型
根据文献[82]以斑马鱼为模型动物，证明血管生长因子受体新型酪氨酸激酶抑制剂可以拮抗斑马鱼血管内皮生长因子受体VEGFR2的表达，特异性的诱导血管内皮细胞凋亡，从而显著抑制斑马鱼的节间血管(ISV),背部纵侧血管区域血管的生长。基于此，本研究选择特异性血管生长因子酪氨酸激酶抑制剂PTK787为工具，制作血管损伤模型。
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结论与展望
结论
该论文以受体色谱以及斑马鱼为药物筛选模型，对中药麻黄进行筛选，在此基础上，对麻黄碱和伪麻黄碱与灸-AR机制进行探讨；利用斑马鱼心血管系统优势，对创新药物丹参素异丙酯在心血管方面的药效学进行研究。作者的主要贡献如下：
1)建立了β2-AR的重氮盐定向固定化新方法，并成功应用于中药活性成分的筛选，为中药活性成分的高效筛选提供了新方法。
2)将定向固定化β2-AR应用于药物-受体相互作用研究，为快速研究药物作用机制提供了借鉴。
展望
本论文通过重氮盐反应将含有His标签的馬-AR键合到硅胶表面，形成亲和色谱，其能够解释药物呈现不同药效的机理，但是还存在些许问题有待进一步研究，问题如下：
第一，定向固定化受体筛选所得活性成分的活性评估研究。
第二，受体色谱探讨受体-药物相互作用的佐证研究。
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参考文献（略）