第一章 绪 论
1.1骨损伤微环境与骨重塑机理
骨折愈合需要经历血肿形成、炎症反应期，血运重建、成软骨期和成骨期等阶段[5-6]。在炎症反应期，炎症因子可刺激干细胞迁移和分化以实现骨损伤愈合；在骨损伤修复过程中，骨髓间充质干细胞和内皮前体细胞发挥重要作用。成人骨损伤的修复过程与胚胎发育过程中骨的正常生长过程相似，都是通过膜内成骨或软骨内成骨[7]，但也存在一些不同，如炎症环境[8]等。在骨折愈合过程中炎症是一个早期事件[9]，了解炎症过程中相关分子机制对于研究炎症与再生之间的关系是十分有益的。关于炎症影响骨损伤愈合的机制（图 1.1），主要通过以下几种介质的作用进行阐述[10]。花生四烯酸的代谢产物中前列腺素E2（PGE2）与牙周附着丧失和骨量丢失密切相关，因此PGE2 的存在对于骨形成是不利的[11-13]。同时PGE2 是骨吸收过程的重要媒介，通过促进RANKL表达并抑制OPG表达对破骨细胞的形成起到积极作用[14]。非甾体类抗炎药物可通过干预PGE2 的合成，减慢牙周或骨破坏的速率[15-17]。由此可知，PGE2 合成的抑制剂有可能促进骨的再生[10]。基于这一推测，有学者通过局部应用非甾体类抗炎药，增强了牙周和骨组织再生[18-19]。尽管已有研究表明PGE2 会促进骨吸收，但也有学者认为PGE2 能够抑制破骨细胞功能[20-21]，给予非甾体抗炎药（如消炎痛、布洛芬等）后负向影响了骨折的愈合，并且该过程是剂量依赖的[22-24]。
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1.2促骨再生生长因子的选择与面临的问题
骨缺损的传统治疗方法尚存在一些不足，如自体骨或异体骨移植尚存在塑形性差、继发损伤或免疫排斥反应等缺陷；牵张成骨技术又因适应症有限、操作技术复杂、价格昂贵等问题，很难普及[3]。基于上述原因，利用相关生长因子促进骨损伤的修复与再生成为一种新兴的替代治疗方法[4]，并且已取得了一些成绩。子骨折损伤修复过程中需要从血液里汲取氧与营养物质，因此，血管生成是骨折损伤修复的关键。促成骨生长因子与促成血管生长因子联合作用，有望起到协同作用，取得更好的骨再生修复效果。基于生长因子在促成骨方面的重要作用，通过分离各种参与骨诱导的蛋白以研究其在骨再生中的治疗潜能，包括BMPs、转化生长因子β（TGF-β）、成纤维细胞生长因子（FGF）、胰岛素样生长因子（IGF）和甲状旁腺素（PTH）等[49]。尽管BMPs参与了很多发育和病理过程，但其在成骨作用方面的研究是最为广泛的[49]。在骨组织中，成骨细胞合成BMPs并将其分泌到细胞外骨基质中[50-52]。在体外，BMPs可以通过BMP/Smad信号通路参与骨的代谢（图1.5）[37]，诱导间充质干细胞分化为成骨细胞表型[53-54]；当体内异位植入BMPs时，可启动骨形成级联反应，包括间充质干细胞的迁移与分化[55]。
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第二章 不同尺寸二氧化硅纳米粒子对MC3T3-E1 细胞摄取及功能影响的研究
随着纳米技术的快速进步与发展，纳米材料由于具有独特的理化性质而越来越受到关注。各国学者正努力研究纳米材料与生物系统间的相互作用，以改善其在诊断中的敏感性和治疗效果。已有一些前期工作证明了纳米粒子的尺寸、形状、表面电荷和表面修饰都会对其与细胞膜的相互作用、细胞摄取和毒性产生影响。而多数研究都是采用肿瘤细胞或肿瘤模型进行的，很少有与骨组织相关的研究。因此，纳米材料与正常细胞或组织间的相互作用应该得到一定关注，尤其是与骨细胞或骨组织间的相互作用。二氧化硅由于具有良好的稳定性、生物相容性和较低的免疫原性，在生物医学领域研究较为广泛。有报道称以二氧化硅为主要成分之一的Bioglass45S5，能够快速诱导材料与骨的结合[3]。因此，应该通过了解二氧化硅与骨细胞或骨组织间的相互作用来促进骨形成。目前，不同尺寸二氧化硅纳米粒子（silica nanoparticles，SNs）对成骨细胞摄取效率的影响尚未开展全面研究，粒子尺寸对成骨细胞相关功能分子表达的影响规律尚未全面建立。因此，开展不同尺寸SNs对成骨细胞摄取效率及功能影响的研究具有重要理论意义。本章实验我们合成了三种不同尺寸的SNs，通过比较其理化性质、细胞摄取、毒性和生物学功能，以明确二氧化硅在促成骨研究方面的作用及前景。
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2.1 实验材料与仪器
2.1.1 实验材料
正硅酸已酯（TEOS，北京化工厂）；无水乙醇（C2H5OH，北京化工厂）；氨水（NH3.H2O，北京化工厂）；异硫氰酸荧光素（FITC，美国Sigma公司）；硅烷偶联剂（KH550，北京化工厂）；小鼠前成骨细胞系MC3T3-E1（中国科学院细胞库）；H-DMEM培养基粉剂（美国Gibco公司）；4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES，美国Sigma公司）；碳酸氢钠（NaHCO3，北京化工厂）；胰蛋白酶粉剂（美国Sigma公司）；胎牛血清（FBS，美国Gibco公司）；青霉素链霉素溶液（美国Gibco公司）；β-甘油磷酸钠（美国Sigma公司）；地塞米松（美国Sigma公司）；抗坏血酸（美国Sigma公司）；茜素红（加拿大BioBasic公司）；氯化十六烷基吡啶（美国Sigma公司）；噻唑蓝（MTT，宝泰克生物有限公司）；4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，美国Sigma公司）；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒（南京凯基生物公司）。所用各种化学试剂均为分析纯。
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第三章 多孔二氧化硅与阿司匹林/BMP-2…....31
3.1 实验材料与仪器 ..........31
3.1.1 实验材料 ...........31
3.1.2 实验仪器 ...........32
3.2 实验方法 ..........33
3.3 实验结果 ..........37
3.4 讨论 ............45
3.5 本章小结 ..........47
第四章 基于阿司匹林的碳量子点的制备.....49
4.1 实验材料与仪器 ..........49
4.1.1 实验材料 ...........49
4.1.2 实验仪器 ...........50
4.2 实验方法 ..........50
4.3 实验结果 ..........54
4.4 讨论 ............67
4.5 本章小结 ..........69
第四章 基于阿司匹林的碳量子点的制备及生物学作用研究
碳量子点在 2004 年首次被发现后就引起了学者们的广泛研究[147]。由于其具有良好的生物相容性和光学性质，因此在生物医学领域具有较好的应用前景。目前，用于制备碳量子点的原料主要包括一些化学试剂如柠檬酸[148]等，也有用蛋白质或核酸[149]为原料的，但由于碳量子点合成过程中温度较高，因此蛋白质或核酸的生物学活性很难保留。因此，我们考虑能否以一些具有生物学活性的药物小分子为原料，合成碳量子点。既能保留原来的生物学活性，同时具有碳量子点的一些性质。本章实验我们合成基于药物阿司匹林的碳量子点（aspirin-based carbon dots，ACDs），并通过化学表征、体外细胞实验和体内动物实验等三方面评价其抗炎作用是否保留。此外，还对其细胞成像和体内生物安全性进行了初步研究，为进一步开展具有双功能或多功能的碳量子点的研究提供实验基础。取 2 g 阿司匹林，加入 8.92 mL 去离子水和 1.08 mL 水合肼（98%），超声溶解。将整个体系转移至 500 mL 烧杯中，500 W 微波 8 分钟，取出加入80 mL 去离子水，超声分散后，转移至渗析袋（分子量为 3500）渗析 5-7 天，每天换液一次。渗析后，渗析袋内液体 8000 rpm 离心 10 分钟，收集上清，用滤器（0.22 μm）抽滤去除杂质和聚集的粒子。剩余液体用旋转蒸发仪悬蒸至 10 mL，冻干后保存。
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结论
本章实验我们通过“一步法”微波辅助的方式合成得到了 ACDs，并从化学表征、体外细胞实验和体内动物实验等三方面证明了其抗炎作用的保留。此外，还对其细胞成像和体内生物安全性进行了初步研究。
（1）通过“一步法”微波辅助的方式合成了基于阿司匹林的碳量子点，所制备的碳量子点均一分散，没有明显聚集，直径分布在 2-6 nm，并具有明显晶格结构；
（2）通过红外、XPS 等化学方法验证了阿司匹林发挥作用官能团的保留，体内动物实验证明了所制备的碳量子点仍具有抗炎作用，体外 Real-timePCR 结果显示在一定浓度时，碳量子点对于炎症因子 TNF-α 和 IL-1β 的抑制作用比药物阿司匹林明显（P<0.01）；
（3）所制备的碳量子点在不同离子强度（KCl 从 0-2.0 M）、不同 pH（从4.0-7.0）和紫外光下连续照射 5 小时时，都能保持良好的荧光稳定性，并且能进入 RAW264.7 细胞，对细胞进行有效标记；
（4）所制备的 ACDs 在生物应用浓度范围内细胞毒性较小，不会对细胞产生明显影响；且体内应用时，不会对血常规、血清生化及心、肝、脾、肾等脏器产生明显影响或毒性。
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参考文献（略）