第一章 农用抗生素的研究进展（文献综述）
1 农用抗生素的定义和发展历史
1.1 .农用抗生素旳定义
农用抗生素（简称农抗），是指由微生物发酵产生、具有农药功能、用于农业上防治病虫草鼠等有害生物的次生代谢产物。放线菌、真菌、细菌等微生物均能产生农用抗生素，其中放线菌产生的农用抗生素最多。目前广泛应用的许多重要农用抗生素都是从链霉菌属中分离得到的放线菌所产生的。从农用抗生素的用途来说，可分为畜用抗生素和植用抗生素两大类，按作用功能来说，可分为杀菌抗生素、杀虫抗生素和除草抗生素。
1.2 农用抗生素的发展历史
农用抗生素的应用开发最早可追溯20世纪40年代。随着抗生素在医用领域的发展，在此基础上，农业研究人员信尝试着利用医用抗生素如链霉素、土霉素、灰黄霉素等进行防治植物上发生的细菌性病害，结果惊奇地发现具有很好的防治效果，而这些细菌性病害在当时缺少有效的防治药剂，这些尝试性的试验研究幵创了农用抗生素的新领域。在这些幵创性的研究基础上，人们开始进行了专门用于农作物病虫害防治的农用抗生素的幵发研究，随着一些有工作的开展，研究人员先后筛选出放线酮、抗霉素和一些多炼类抗生素等一些农用抗生素。20世纪50年代后，由于农药化工的快速发展，加上化学农药的高效，世界各国的农业大量地使用化学农药，农药残留造成的环境及人身健康等问题突显出来，面对化学农药的污染问题则使得人们意识到的生物源农药在环境、身体健康等方面的安全性优势，科研人员开始更多地在微生物农药研究上开展更多的工作，这促进了农用抗生素在这一时期较快的发展，尤其日本在这方面处于领先地位。由于曰本当时长期大量使用萊制剂防治水稻稻瘟病造成了严重萊污染问题，日本在稻瘟病防治上开展了大量抗生素研发工作，并在1961年成功地开发出世界上第一个大规模生产的农用抗生素杀稻痕素一S，该抗生素对稻瘋病具体明显的防治作用，它成功地替代了对环境污染、人畜毒害严重的有机萊类化学农药。在这之后，日本研究者又陆续幵发了诸第一章农用抗生素的研究进展（文献综述如多氧霉素、春日霉素、有效霉素等许多新品种的农用抗生素。随着日本大量开发并成功推广应用了许多新研制的与医用抗生素不同的农业专用抗生素以后，由此带来的良好的社会效应及直接的经济效益也逐渐引进了美国、西欧、苏联等国家的重视，并开始加强农用抗生素的研究开发。现在美国、俄罗斯、日本、印度、丹麦等国，均将农用抗生素研究幵发列入国家重点规划。
2 农用抗生素的分类
2.1 根据农用抗生素按化学组成及分子结构上划分
2.1.1 氨基糖苦类抗生素
氨基糖昔类抗生素又称氨基环醇类抗生素，是含有一个环乙醇配基并以糖苷键与氨基糖连接而成的一类有机化合物。目前农用抗生素中的井阿霉素、中生菌素、春雷霉素、瑞拉霉素等属于这一类抗生素。
春雷霉素是氨基糖苦类农用抗生素中的典型代表，其产生菌为小金色链霉菌，纯品为白色粉末，焰点为202-204°，易溶于水，不溶于甲醇、乙醚、丙酮、醋酸乙酷、醋酸丁酷、氯仿、苯及石油酸等。春雷霉素具有较好的稳定性，常温条件下存放5-10周效价不降低，它的水溶液也具有同样稳定性。在农业上控制稻疽病可代替有机萊剂，优点是水中溶解度大，不残留在谷粒及土壤中，几乎没有毒性。
化学名称为{5-氨基-2-甲基-6（2、3、4、5、6）-基环己基-2-氨基-a-亚氨己酸}，其化学结构式如下：
2.1.2 核苷类农用抗生素
核苷类农用抗生素是在各种微生物的次级代谢物中发现的，包括各种结构改造的核苷和核苷酸化合物，通常分子结构复杂。核苗农用抗生素的生物活性范围广泛，包括抗细菌、抗真菌、抗、病毒、除草等生物活性。核苦抗生素具有这样的生物活性是由于其在最基本的细胞代谢途径中能发挥多项作用，诸如蛋白质合成、聚糖合成以及糖蛋白合成都是核苷抗生素的作用对象。农用抗生素中的多氧霉素、杀稻痕菌素、米多霉素、农抗、尼可霉素、武夷菌素、多抗霉素、抑霉菌素、庆丰霉素、灭粉霉、华光霉素、宁南霉素、日光霉素和庆丰霉素等均为核苷类抗生素。
第二章 括抗放线菌的筛选与鉴定
第一节 拮抗放线菌株的蹄选
放线菌作为产生抗生素最多的微生物类群，一直是新抗生素的主要来源菌群，由于自然界中放线菌种类多并且同种的不同菌株在次生代谢产物方面也存在着较大的不同，因此从自然环境中进行拮抗放线菌的分离与筛选是农用抗生素研发的第一步。本文将从土壤样品中分离纯化到的不同种类的放线菌株用目标指示病原菌进行对峙培养，并对筛选出来的具有拮抗活性好的菌株用于下一步复选活性测定，以蹄选出活性强烈的菌株来开发抗生素类活性成分。菌株的复选主要进行液体发酵液活性测定，对活性明显的菌株进行下一步研究。本试验采用高氏一号培养基从土壤中分离各种放线菌，以番煎灰霉病菌作为勒标，釆用对峙培养法和杯碟法分别测定桔抗菌株的活体和无菌发酵液的抑菌活性能力，进行有开发潜力的生防菌株蹄选。
1.1 放线菌株的分离纯化
1.1.1 土壤样品釆集方法
用于放线菌分离的土壤样品主要从辽宁、吉林、黑龙江、湖北、重庆、福建、云南等多地的农田、山区、森林等不同生态环境中的土壤中随机釆集，共釆集了土壤样品33份。土样采集方法：用取样小产除掉表土，取5-20cm深处的土壤200g左右装入样品袋中，并记录釆集地、采集时间。采集的土壤样品，带回实验室后用于放线菌株的分离。
第二节 放线菌S-091菌株的种类鉴定
放线菌（是原核生物的一个类群，它的分类和鉴定经过了漫长的研究阶段，到目前为止，放线菌的分类鉴定方法主要经历了个发展阶段，即经典分类方法、数值分类主页、化学分类方法、分子分类主页及放线菌多相分类系统。传统分类方法是认识物种起源和物种多样性的重要手段，是放线菌分类的基础。传统分类中的形态特征、培养特征及生理生化特性等表观分类学信息是人们认识放线菌物种的最基本特征之一。放线菌的分子鉴定是随着分子生物学技术的快速发展而逐渐发展起来的，通过在分子水平上研究生物进化以及分类关系，能够更好地从分子遗传水平确定放线菌的遗传分类关系，因此，分子鉴定在放线菌分类学研究中起到越来越重要的作用。本文主要通过研究从菌株的形态特征、培养特征及生理生化特性等经典分类依据，并结合分子生物学方面的遗传鉴定对目的菌株进行了种类的鉴定研究。
1 材料与方法
1.1 供试材料
菌株：拮抗链霉S-091菌菌株。
放线菌培养特征培养基：高氏一号琼脂培养基；葡萄糖天门冬素培养基；鹿糖察氏培养基；葡萄糖酵母膏琼脂培养基；克氏合成一号琼脂培养基；马铃薯葡萄糖琼脂培养基；马铃薯块培养基；酵母膏麦芽膏琼脂培养基；无机盐淀粉琼脂培养基；瓦氏肉汁琼脂培养基；贝奈特培养基；伊莫松培养基；甘油天门冬素琼脂培养基。
第三章 S-091菌株发酵条件研究................................51
1 材料与方法................................................51
2 结果与分析................................................54
3 小结......................................................63
第四章 活性成分理化特性、分离鉴定及抑菌机制.................65
第一节 发酵液活性稳定性研究.................................65
1 材料与方法................................................65
2 结果与分析................................................66
3 小结......................................................71
第二节 S-091抑菌活性物质初步分离与鉴定......................72
1 材料与方法................................................72
2 结果与分析................................................75
3 小结......................................................79
第三节 S-091活性物质抑菌作用与机制..........................80
1 材料与方法................................................80
2 结果与分析................................................82
3 小结......................................................87
第五章 S-091菌株抑菌活性物质的分离纯化及结构鉴定............88
第一节 S-091菌株活性物质的分离纯化..........................88
1 材料与方法................................................88
2 结果与分析................................................91
3 小结......................................................96
第二节 S-091菌株活性物质结构分析............................98
1 材料与方法................................................98
2 结果与分析................................................98
3 小结......................................................101
第五章 S-091菌株抑菌活性物质的分离纯化及结构鉴定
放线菌产生活性物质种类多，也往往具有化学结构复杂等特点，因此，农用活性物质的开发研究中，对活性成分的化学成分组成与分子结构分析也是研究中的最为重要的内容，通过对未知的活性成分化学分子组成与结构的明确，才能确定新蹄选的活性物质是己知成分还是新化合物，也为化合物的活性结构的改造提供了可能。同时，未知成分的化学组成与结构分析也是活性物质研究中的难点之一。目前，更多地应用气质联用、液质联用、质谱、核磁等先进技术进行化合物的组成与结构分析。
第六 章结论与讨论
放线菌农用活性物质的研究中从自然界中蹄选对靴标菌具有良好拮抗活性的菌株是该方面研究工作的基础也是最重要的一步，只有蹄选了措抗活性好的菌株，才有可能在后续的研究中发现新的农用活性物质品种。本文对采自不同地区的33份土壤样品利用稀释分离法进行了放线菌菌株的室内分离筛选，共获得了92个放线菌菌株，并对这些菌株针对番茄灰霉菌的拮抗活性进行了初选测定，发现其中共有8个菌株具有抑菌活性。在拮抗菌的筛选过程中，淘汰率也相当高，即便是活体抑菌效果良好的菌株，发酵液未必呈现明显的抑菌作用，而且，活体和发酵液的抑菌谱也并不一定相同，因此对上述8个菌株进行了发酵液抑菌活性测定，结果表明S-091具有非常好的抑菌活性。 在此基础上，本文以S-091菌株作为研究开发菌株用于下一步的研究开发，并对S-091菌株对多种病原菌的拮抗活性的广谱性进行了研究测定，结果表明无论是在活体与不同病原菌的对峙培养中，还是用S-091菌株发酵液的抑菌测定中，均表现出了对多种植物病原真菌的强烈拮抗作用，具有较好的研究开发潜力。尽管在土壤中含有丰富的放线菌，但由于相同生境的土壤样品可能存在放线菌种类多为相同种类，因此在分离过程中通过对大量获得的菌株根据菌落形态进行初步的归类后，实际上分离获得的放线菌不同种类的菌株数量相对较少，而其中具有拮抗活性的菌株比例更低，多数菌株完全没拮抗活性。此外，有的菌株在对峙培养中有活性，但在发酵培养中又没有活性或活性很，当然，这里存在着可能由于菌体本身的特点与发酵条件存在是否适宜的可能。但在农用活性物质研发中还要考虑到未来的幵发成本，在这一步研究中多数以实际生产中可行性的发酵营养条件作为研究前提。因此，在措抗菌的室内蹄选中，要对蹄选获得的拮抗放线菌的活体、发酵液、发酵液稳定性的效果等多方面综合评价，才有可能蹄选到具有研究潜力的生防菌株。
参考文献（略）