第一章 绪论
1.1 课题背景介绍
1.1.1 恶性淋巴瘤概述
非霍奇金淋巴瘤作为淋巴系统最常见的恶性增殖性疾病，在发达国家和发展中国家的发病率逐渐增高，全世界每年大约有 36 万人被诊断为该疾病，可见于各个年龄组，年病死率为 1.9-3.6/10 万[6]。2014 年的统计结果显示，非霍奇金淋巴瘤在美国的新发恶性肿瘤病例数中已位列第七，高于白血病[7]。在所有 NHL中，弥漫大 B 细胞淋巴瘤 (diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL) 是最常见的类型，约占全部NHL的30%-40%，其次是高度恶性滤泡淋巴瘤 (follicular lymphoma,FL)、套细胞淋巴瘤 (mantle cell lymphoma, MCL) 和 T 细胞淋巴瘤 (T-celllymphoma, TCL)。非霍奇金淋巴瘤的病理类型临床表现和治疗上远比霍奇金淋巴瘤复杂，从现有的资料看来，NHL 是一组很不均一的疾病，病因、病理、临床表现和治疗都有差异，迄今为止，总体治愈率也低于 HL。
淋巴瘤在世界范围内的发病率逐年升高，可能的原因可大致归纳为：①免疫功能异常，如艾滋病器官移植、类风湿关节炎和遗传性免疫缺陷等；②病毒，如成人 T 细胞淋巴瘤病毒 (HTLV)、艾滋病病毒 (HIV)、EB 病毒 (EBV) 等；③化学物质，如杀虫剂、除草剂、农药、染发剂、苯、重金属等；④其它，如放射性暴露和霍奇金淋巴瘤治疗等。目前尚未发现淋巴瘤有非常明显的遗传倾向和家族
淋巴瘤的发病部位不一，临床表现多样，即使是在同一亚型中，由于基因表达谱的不同，其临床表现、疗效以及预后也各不相同，因此与其它肿瘤相比，诊断更加困难。目前人们已知的淋巴瘤有 70 多种不同类型，各类型的治疗方案及预后差别非常显著。病理诊断依旧是淋巴瘤诊断的“金标准”，其前提是要能够获取足够的高质量的肿瘤组织。虽然活检比较麻烦，甚至有时会有风险，但是这对于淋巴瘤的确诊是必须的。某些情况下，会出现取材不理想，则须要再次活检，更有少数情况甚至须要多次活检；对于有疑问的病例，有可能须要多位经验丰富的病理专家会诊。淋巴瘤复发时也要尽可能地再提取相关组织进行病理诊断，一方面是为了明确疾病是否复发，另一方面是因为某些类型的淋巴瘤确有可能会发生病理转化。
1.2 本研究的意义与研究内容
由于本人在博士前期阶段做了一部分氨基糖苷类抗生素质量研究的工作，故本文第六章将单独对相关内容做一介绍。氨基糖苷类抗生素 (aminoglycoside antibiotics) 是临床上常用的抗生素，具有抗菌谱广、抗菌能力强、化学性质稳定、水溶性好以及吸收排泄良好的特点，可通过微生物发酵或半合成而制得，是一类由单组分或多组分组成的糖基取代的氨基环醇类化合物。虽然近年受到β-内酰胺类和喹诺酮类抗感染药物的挑战，但仍是治疗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和结核杆菌感染的首选药物一。
随着我国氨基糖苷类抗生素原料药产品的不断出口，要求我们的抗生素生产厂商严把质量关，确保药品纯度和杂质的含量符合欧洲和美国药品出口的要求。由于该类抗生素的结构中不含有紫外吸收基团，因此，欧洲药典和美国药典多采用柱前衍生化的HPLC法测定其含量。《中国药典（2010年版）》收载的氨基糖苷类抗生素，其含量测定方法基本上都采用微生物检定法。由于微生物法测定的是各种活性组分的总活性，并不能准确地反映其内在质量，而衍生化反应受反应温度、反应时间及衍生化试剂的质量等因素的影响，柱前衍生化HPLC法也较难对该类抗生素的质量进行全面准确的评价。
近年来在制药企业应用越来越广泛的蒸发光散射检测器 (ELSD) 由于其响应值不依赖被测物质的光学性质，任何挥发性低于流动相的物质均能被检测，并且具有响应因子一致性，灵敏度高于示差折光检测器，现已逐渐成为常用的半通用型检测器。本文将对盐酸大观霉素、硫酸阿米卡星及硫酸链霉素进行高效液相色谱分离-蒸发光散射检测器检测的分析方法研究，为相关药品的质量提升做出有益的探索。
对于发现恶性淋巴瘤发病的代谢物变化及其分子机制或许是一种新颖而有效的工具。代谢组学研究常用的样本如尿液和血清/浆，都是无创或微小创伤的，方便用于临床。本研究中，代谢组学方法若能够准确诊断区分出非霍奇金淋巴瘤患者与正常对照，并筛选出灵敏度高、特异性强的病变标志物，则将能够很好地改善目前恶性淋巴瘤在早期筛查和诊断方面的困境，并且将进一步推动研究这种疾病发生、发展的机制。基于代谢组学的特点与优势，我们考虑从代谢物全谱分析的角度去研究淋巴瘤病理过程所产生的代谢产物中的特异性指标成分，揭示其潜在生物标志物，对于非霍奇金淋巴瘤的早期诊断、分型、疗效预测和发病机制的阐明将会有重要的意义。
第二章 基于 UPLC-QTOFMS 的非霍奇金淋巴瘤血清代谢组学研究
2.1 引言
当前，代谢组学技术已被广泛应用于临床相关研究，如肿瘤疾病、心血管疾病、糖尿病等代谢类疾病，并取得了相当多的基础性研究成果[1,2]。例如，用于筛选与肿瘤疾病密切相关的生物代谢标志物，便于早期诊断[3-5]；以及根据代谢轮廓的变化探索病因与发病的机制[6]。非目标性代谢组学研究是一种广谱的全面分析方法，样本中的所有代谢物组分都是潜在的测定对象，因此要求分析方法具有高灵敏度、无偏向性和高通量性。并且由于生物体内源性小分子代谢产物其种类繁多，结构、性质及浓度变化范围等理化参数差异很大，为了能够检测到尽可能多的机体内的代谢物，必须使用合适的分析技术平台。
质谱检测器在灵敏度以及动态范围上要优于核磁共振谱仪[7]；色谱是一种非常有效的分离技术，与质谱检测联用后便可以提供丰富的化合物结构信息，从而有利于复杂样品的定量与定性分析。随着分离技术与质谱仪的不断改进和优化，色谱-质谱联用技术的优势日益体现，成为目前最重要和应用最广泛的分离分析和鉴定方法之一[8]。其中，液相色谱-质谱技术由于其所能分析的化合物极性范围广，对不易挥发和热不稳定的物质非常适宜，因而具有更广阔的应用空间。LC-MS 技术避免了GC-MS 分析中繁杂的样品前处理步骤，而且可以直接分析难挥发性化合物、极性化合物、热不稳定化合物及大分子化合物（如蛋白质、多肽、多糖、多聚物），而不必进行衍生化反应。同时，LC-MS 技术又具有较好的选择性，较高的灵敏度和较宽的动态范围，因而在代谢组学研究中得到了越来越广泛的应用。
就液相色谱系统而言，由于其存在多种分离机制，可以根据须要，通过使用反相、正相、离子交换、离子对、排阻或亲和作用等色谱柱[9]，选择性地分离分析目标代谢产物。选用超高效液相色谱 (UPLC)、微径液相色谱 (micro-HPLC)、毛细管电色谱 (CEC) 或者多维色谱联用等技术可以明显提高分离效率[10]，适用于样本中代谢物的全谱分析，因此液相色谱已经成为代谢组学研究的重要技术平台，发挥着不可替代的作用。
2.2 实验材料
2.2.1 仪器
超 高 效 液 相 色 谱 - 单 四 极 杆 飞 行 时 间 质 谱 （ ultra performance liquidchromatography and quadruple/time-of-flight mass spectrometry, UPLC-QTOFMS,Waters, Milford, MA, 美国），配电喷雾离子源 (ESI)；ACQUITYTM2.1 mm × 100 mm,1.7 μm BEH C18 色谱柱，加 UPLC C18 保护柱 (2.1 mm × 5 mm × 1.7 μm)（Waters,Milford, MA, 美国）；飞鸽牌 TGL-16G 型低速离心机（上海安亭科学仪器厂）；XW-80A 型漩涡混合器（上海青浦沪西仪器厂）；5417R 型超速低温离心机（Eppendorf，德国）；KQ2200B 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；BT224S 型万分之一分析天平（Sartorius，德国）。
2.2.2 试剂
甲醇 (MeOH)、乙腈 (ACN)（色谱纯, Merck, Darmstadt, 德国）；Mili-Q 去离子水（Millipore, MA, 美国）；甲酸 (FA)（色谱纯, Tedia, OH, 美国）；色谱级甲酸铵购自阿拉丁试剂（上海）有限公司；亮氨酸-脑啡肽（Sigma-Aldrich, MO, 美国）；L-2-氯苯丙氨酸（上海瀛正科技有限公司）；游离脂肪酸标准品（上海安谱科学仪器有限公司）；溶血磷脂酰胆碱标准品（Avanti polar lipids, AL, 美国）；其它对照品购自Sigma-Aldrich 公司；其它试剂均为市售分析纯。
2.2.3 样本的收集与临床信息
本实验分别收集了两批患者组与健康对照组样本，分别于 2010 年 11 月与 2012年 2 月进行了两次 UPLC-QTOFMS 分析测试。
(1) 非霍奇金淋巴瘤患者组的血清样本采集
患者组的样本收集自上海交通大学医学院附属瑞金医院血液科的初治非霍奇金淋巴瘤住院患者，均经病理组织学证实为 NHL，均有可测量肿瘤病灶。目前医学界通常按照 AnnArbor 在 1966 年提出的临床分期方案，将淋巴瘤分成Ⅰ-Ⅳ期。该分期最初用于霍奇金淋巴瘤，并于 1971 年被用于非霍奇金淋巴瘤，作为分期的参照。
第三章 基于 UPLC-QTOFMS 的非霍奇金淋巴瘤尿液代谢组学研究......58
3.1 引言....................................................58
3.2 实验材料.................................................58
3.2.1 仪器..................................................58
3.2.2 试剂..................................................58
3.2.3 样本的收集与临床信息.....................................59
第四章 基于 GC-TOFMS 的非霍奇金淋巴瘤血清代谢组学研究........84
4.1 引言..........................................................84
4.2 仪器与试剂.................................................85
4.2.1 仪器.........................................................85
第五章 UPLC-QTOFMS 和 GC-TOFMS 联合应用的非霍奇金淋巴瘤代谢组学研究...98
5.1 引言............................................................98
5.2 NHL 差异代谢物的整合..........................................99
第三章 基于 UPLC-QTOFMS 的非霍奇金淋巴瘤尿液代谢组学研究
3.1 引言
从第二章基于血清样本的代谢组学研究结果可以发现与正常人相比，非霍奇金淋巴瘤患者的相关代谢通路受到影响，其代谢轮廓发生明显改变。说明采用代谢组学的方法来寻找差异代谢物，继而获得非侵入性的诊断标志物具有可行性，并为疾病的机制研究提供一定的依据。尿液同样也是代谢组学研究中最常用的生物体液之一。尿样中包含大量的有机酸、碱、单糖、多糖、杂环、多元醇、氨基酸、低分子量的蛋白质和多肽以及无机盐等，这些化合物的变化情况直接反映了生物体内各种化学变化过程[1]。
本章依然采用 UPLC-QTOFMS 作为分析平台，对非霍奇金淋巴瘤患者和正常人的尿液样本进行代谢组学研究，考察疾病患者的代谢轮廓的改变，并应用模式识别技术，多维与单维统计分析相结合的方法筛选具有显著组间差异的变量，再对差异代谢物进行鉴定，最后探讨非霍奇金淋巴瘤患者的代谢模式的改变。
本研究中所有被收集样本的患者及健康志愿者均签署了知情同意书，并详细说明本研究的目的和方法。在样本收集前一天要求健康志愿者食用清淡饮食，避免海鲜以及辛辣食物，并禁止采样前一天吸烟、喝酒、剧烈运动，以减少非疾病因素对代谢造成的波动，采样时取中段晨尿。为了减小由疾病以外因素引起的代谢水平的差异，在收集各组样本时，尽量挑选年龄、性别相匹配的人员。
通过对不同处理方法获得的总离子流图中色谱峰数量、峰强度的考察，获得每种方法对各成分的提取效果。最终确定尿样的预处理方法为：取各尿液样品，于室温解冻，涡旋混匀，取 500 μL 置于离心管中，加入 500 μL 超纯水，混旋 1 min，在4℃下以 13000 rpm 的转速离心 15 分钟，取上清液 600 μL 于进样小瓶。该方法简便易行，尽可能多地保留代谢组分的同时也兼顾色谱柱的耐受性，适合用于尿液样本代谢组学研究的高通量检测。
总结
代谢组学的核心观点认为个体的代谢状态能够非常紧密地反映其健康状态。由本章结果可以看出，以血清代谢轮廓构建的 OPLS-DA 模型可以很好地区分 NHL 组与正常组。非霍奇金淋巴瘤患者的血清代谢物组的异常变化与患者的年龄、性别、乳酸脱氢酶、AnnArbor 分期、IPI 评分、结外病变无明显关联。
本研究进行了两次实验重复验证，采用多维与单维统计分析相结合的思路对差异性代谢物进行了选定与鉴定，研究发现，10 个重要差异代谢物表征了与非霍奇金淋巴瘤相关的代谢通路变化。其中，十羧基卟啉和 N1-（2,4-二甲氧基苄基）-N2-（2-（吡啶-2-基）乙基）草酰胺在患者血清中的浓度升高；2,3-DINOR-6,15-二酮-13,14-二氢-前列腺素 F1a、2-花生四烯酸甘油酯、姜辣二酮、葫芦素 H、3α,7β,12α-三羟基-6-氧代-5α-胆烷-24-酸、葫芦素 S、胆碱及山梨糖醇油酸酯在血清中的浓度降低。确认与非霍奇金淋巴瘤密切相关的代谢变化包括花生四烯酸代谢、类固醇代谢、胆汁酸代谢、氨基酸代谢、糖代谢及卟啉代谢，以脂类物质的代谢变化最为明显。该结果不但为监测疾病状况下代谢物的体内变化提供了坚实、可靠的依据，同时为今后治疗淋巴瘤的药物靶点的寻找提供了可能。
参考文献（略）