第一章 前 言
急性胰腺炎不是仅局限于胰腺和周围组织的一种局部炎症反应，而是能够发生低血压、器官灌注不足、成人呼吸窘迫综合征(adult respiratory distress syndrome ，ARDS)、多器官功能衰竭综合征(multiple organ dysfunction，MODS)等症状直至死亡[1]。后者即为全身症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，它是由于重症胰腺炎(severe pancreatitis，SAP)早期胰腺无菌性坏死、胰酶被激活，胰腺释放的内容物刺激机体产生大量的细胞因子及炎性介质，引起持续的全身性炎症反应，最终导致机体组织和器官功能异常或障碍的一个复杂过程[2]。目前认为，感染和SIRS是影响SAP发生、发展和转归的关键环节[3]。通常情况下，急性胰腺炎病情较为轻微，而且是具有可控性的，但是最后被确诊为SAP的患者占其四分之一，或因为局部并发症，或因为全身并发症。其中近一半的重症急性胰腺炎患者会表现为SIRS，而且会有20-30％的重症患者由于MODS而死亡。有研究表明，SAP合并SIRS时间越长，患者预后效果越差。根据SAP患者手术时机的选择是临床实践中最具有争议的话题之一这一事实，目前急性胰腺炎的治疗仍以内科综合治疗为主，针对此炎症尚无十分有效的药物，因此寻找到具有抗炎作用的治疗药物具有重要的经济价值和社会意义。
青蒿琥酯是抗疟药青蒿素(artemisinin，AS)的水溶性衍生物。青蒿琥酯具有多方面的药理作用，已经证实具有抗疟疾、抗肿瘤、治疗弓形虫感染、抗血吸虫、抗孕、平喘、抗病毒等多种药理活性[4]。除此之外，目前已经有大量文献报道青蒿琥酯的抗炎作用。梁爱华等报道青蒿琥酯显著抑制内毒素在体内和体外对巨噬细胞的激活作用，从而表明青蒿琥酯可减轻内毒素引起的炎症反应[5][6]。王燕燕等报道青蒿琥酯可显著降低滑膜细胞内Bcl-2 和NF-κB的蛋白表达水平，从而有效改善佐剂性关节炎大鼠的滑膜病变[7]；有报道称青蒿琥酯通过调节NF-kB活性抑制脂多糖诱导的类风湿关节炎滑膜细胞分泌TNF-α，表明青蒿琥酯可能具有抑制类风湿关节炎滑膜炎症的作用[8]。Chen.H 等发现中等剂量的青蒿琥酯对小鼠系统性红斑狼疮样、变应性接触性皮炎等小鼠模型有很好的抑制作用[9]；而高春芳等也发现青蒿琥酯对小鼠系统性红斑疮模型有明显的治疗作用[10]。本课题组前期的研究也表明，青蒿琥酯对LPS诱导的单核巨噬细胞释放炎症因子有抑制作用，对细菌脓毒症模型小鼠具有显著的保护作用[11]。综上所述，急性胰腺炎是一种由局部炎症发展到全身的炎症反应性疾病，而青蒿琥酯具有一定的抗炎作用，因此推测青蒿琥酯对急性胰腺炎可能具有治疗作用。本课题首先分别建立急性胰腺炎小鼠和大鼠模型，以这些模型为基础研究青蒿琥酯对急性胰腺炎的治疗作用。以期阐述青蒿琥酯作为治疗急性胰腺炎的潜在能力，从而推动急性胰腺炎的治疗研究的进展。
第二章 青蒿琥酯对重症急性胰腺炎模型小鼠的治疗作用
2.1 材料和方法
2.1.1 实验动物：昆明种小鼠(清洁级)，18-22 g，4-6 周，雌雄各一半，第三军医大学实验动物中心，许可证号SCXK-(军)2007015。
2.1.2 主要试剂生理盐水 西南药业公司
雨蛙素多肽 生工(上海)股份有限公司
脂多糖(大肠杆菌 055:B5) 美国 Sigma 公司
4%多聚甲醛 武汉 Boster 公司
青蒿琥酯注射液 桂林南药股份有限公司
淀粉酶试剂盒 南京建成 研究所
胰蛋白酶试剂盒 南京建成 研究所
脂肪酶试剂盒 南京建成 研究所
超氧化物歧化酶试剂盒 南京建成 研究所
2.1.3 主要仪器
YP6001M 台式电子天平 上海科学仪器有限公司
FA2104N 型 HANGPING 电子天平 上海科学仪器有限公司
MA11 0分析天平 沈阳龙腾电子有限公司
照相机 日本 Canon 公司
SC-15 型数控超级恒温槽 宁波新芝生物股份有限公司
GB11240-89型电热恒温水浴锅 北京市医疗设备意成公司
VORTEX-GENIUS3 型涡旋振荡器 德国 IKA 公司
SC-48 型高通量组织研磨器 宁波新芝生物股份有限公司
1500-741 全波长扫描仪 美国 Thermo 公司
3K18型低温高速离心机 美国 Sigma 公司
TDL-50B 型台式低速离心机 上海安亭科学仪器厂
纯水机 美国 Millipore 公司
96 孔微孔板 美国 corning 公司
移液器 Eppendorf 公司
无菌注射器 上海康德莱公司
电冰箱 海尔集团
LKB2088型超薄切片机 Leica公司
TECNAI10 型透射电子显微镜 Philips 公司
SKT84 型聚合器 上海科技大学
LKB7800 型制刀机 Bromma 公司
MN-72 型磨刀机 SAKURA
820 型石蜡切片机 美国 AO 公司
CH30型光学显微镜 日本Olympus 公司
显微摄影仪 日本 Olympus 公司
2.1.4 动物模型的制作
2.1.4.1 健康的清洁级昆明小鼠16只，体重18-22 g，雌雄各8只，购买于三医大实验动物中心，许可证号SCXK -(军)2007015；
2.1.4.2 将 16只小鼠分别称重后，完全随机分成 2 组，每组 8 只。即正常组和模型组；
2.1.4.3 16 只实验小鼠在给药前禁食14 小时，但要正常饮水；
2.1.4.4 用无菌的生理盐水分别配制雨蛙素10 μg/mL和脂多糖1 mg/mL。脂多糖的配制方法：取适量的脂多糖冻干粉加入到相应的无菌生理盐水中，振荡2-3 h，待其全部溶解，备用；
2.1.4.5 腹腔注射雨蛙素100 μg/kg，1次/小时，连续6次注射，6次雨蛙素注射之后，按照10 mg/kg立即腹腔注射脂多糖，诱导 AP 模型；
2.1.4.6 取血后，采用颈椎脱臼法处死小鼠，剖腹取胰腺，称其湿重；
2.1.4.7 观察胰腺和周围组织，拍照，称重：记录水肿、充血、坏死等现象；2.1.4.8 取适量胰腺组织，按体积(毫升):重量(克)=9:1 的比例，加入其 9 倍体积4 ℃预冷后的生理盐水，再用高通量组织研磨器制成组织匀浆液，浓度为原组织的10%，(研磨 20 s/次，50 Hz，3 至 4 次，需在冰浴中进行)，离心10分钟，3500 转/分钟，取上清-20 ℃保存，待测定生化指标；
2.1.4.9 造模完成后18 小时取血，用眼眶取血方法收集实验小鼠的血液，同时不抗凝；将收集好的血样在4℃放置2 h后，3500 r/min离心、12 min，取上清，放置于-20 ℃冰箱，以待测各种生化指标。
2.2 结 果
2.2.1 模型建立后相关指标检测
2.2.1.1 模型小鼠胰腺组织的大体观察
正常组小鼠饮水、活动良好，没有出现任何异常反应。解剖时观察到：该组小鼠胰腺组织没有看到任何明显的异常，胰腺及周围组织结构界限十分清晰；胰腺颜色正常，没有观察到水肿、充血等现象；腹腔内没有明显的积液；无出血和坏死性病变。模型组小鼠急性胰腺炎造模成功18 h后，胰腺组织体积增大，胰腺质地稍硬，界限结构模糊，出现明显的肿胀和充血；胰头和胰尾水肿最为突出，颜色呈现暗红色；胰腺表面可以看到多处的皂化斑点；腹腔内有少量的积液，肠系膜和大网膜处有明显的皂化斑，胰腺与周围组织粘连较严重。
2.2.1.2 胰腺系数的改变
实验结果显示，模型组小鼠的胰腺系数明显升高，与正常组相比，具有显著性统计学差异(n = 8,P<0.05)(图 2 )。提示雨蛙素联合脂多糖致小鼠急性胰腺炎模型建立成功。
第二章 青蒿琥酯对重症急性胰腺炎模型小鼠的治疗作用
2.1 材料和方法
2.2 结 果
2.3 小 结
第三章 青蒿琥酯对重症急性胰腺炎模型大鼠的治疗作用
3.1 材料和方法
3.2 结 果
3.3 小 结
第四章 青蒿琥酯对急性胰腺炎治疗作用的分子机制研究
4.1 材料和方法
4.2 结 果
4.3 小 结
全文讨论
一、急性胰腺炎与脓毒症
急性胰腺炎是临床常见病，发病率高，发病急，病情发展快而复杂。不仅仅是局限于胰腺及其周围组织的局部炎症反应，而且能呈现出低血压、器官灌注不足、成人呼吸窘迫综合征、多器官功能衰竭综合征等症状直至死亡[13]。也就是说，急性胰腺炎可从最初的胰腺组织的局部病变迅速发展成为全身炎症反应综合征、脓毒症、脓毒症休克乃至多器官功能衰竭，甚至死亡。全身性炎症反应综合征，即SIRS，它是由于SAP早期胰腺无菌性坏死、胰酶被激活，胰腺释放的内容物刺激机体产生大量的炎症介质和细胞因子，从而引起持续性的全身性炎症反应，最终导致整个机体的组织和器官功能异常一个复杂过程[14]。目前认为，感染和SIRS是影响SAP发生、发展和转归的关键环节[15]。大多数情况下，急性胰腺炎是较轻微且可控的，但局部和/或全身并发症仍能造成高达 25％的重症急性胰腺炎。50%的重症急性胰腺炎患者发展为SIRS，而 20-30％的重症患者由于MODS而死亡。因此，深入了解SAP脓毒症的发病机制、研究新的有效药物对于进行SAP早期有效的临床干预措施大有裨益。
急性胰腺炎是由各种原因引起的全身炎症反应综合征，脓毒症是由感染因素导致的 SIRS，又称 SIRS 亚型。鉴于 SIRS 贯穿急性胰腺炎的病理生理过程，早期阶段的 SIRS 如果得不到有效控制，晚期将出现脓毒症、脓毒症休克，发生多器官功能衰竭的风险将大为增加，病死率也将增 加 4～5 倍。因此，急性胰腺炎的本质是 SIRS和脓毒症。
全文总结
一、青蒿琥酯对急性胰腺炎模型小鼠的治疗作用
1.成功建立雨蛙素联合 LPS 致急性胰腺炎小鼠模型。
2.通过青蒿琥酯的治疗，急性胰腺炎小鼠的胰腺组织的病变程度有了明显的改善，其血清 AMS、胰蛋白酶、脂肪酶活力以及 MDA 含量得到显著降低，胰 SOD 活力明显升高。
二、青蒿琥酯对重症急性胰腺炎模型大鼠的治疗作用
1.采用逆行性胆胰管注射牛黄胆酸钠的方法，成功建立重症急性胰腺炎大鼠模型。
2.通过青蒿琥酯的治疗，重症急性胰腺炎大鼠的胰腺组织的病变程度有了明显的改善，其血清 AMS、胰脂肪酶活力以及 MDA 含量有显著降低，胰 SOD 活力明显升高，IL-6 也有明显的降低。
三、青蒿琥酯对急性胰腺炎治疗作用的分子机制研究
1.采用逆行性胆胰管注射胶原酶的方法，成功分离大鼠胰腺腺泡细胞。
2.通过青蒿琥酯干预 LPS 刺激后的腺泡细胞，采用 Elisa 和 RT-PCR 实验检测到，青蒿琥酯能够抑制胰腺腺泡细胞 IL-6 和 IL-1β 的释放，降低 IL-6、IL-1β、TLR2、TLR4和 p65 的 mRNA 的表达。
3.青蒿琥酯可能通过抑制 TLRs/NF-κB 通路的活化，抑制相关重要分子的表达，减少促炎性因子的产生，发挥抗炎作用。