第一章细胞内基于核受体PXR及CYP3A4启动子双荧光报告基因平台的建立及活性中药单体筛选
1研究背景
PXR是第一个被发现可调节人和哨齿类动物CYP3A基因的核受体[5_8]。Goodwin[9]等人通过构建CYP3A4启动子区一系列不同片段长度的突光报告基因，确定了-7836~-7208/-362~+53位存在与PXR的结合位点。同时构建上述位点突变质粒，发现该区域若存在突变，其诱导活性将减弱。染色质免疫共沉淀法和胶迁移率实验证明CYP多个亚家族基因启动子区的调控序列中均有与PXR特异性结合的应答元件，此类应答元件作为IE基因调控序列通常以DR-3(DirectReceptor, DR)、外向重复 ER-4(Evened Repeat, ER)和反向重复 IR-6(InvertedReceptor, IR)的形式存在。合形成异源二聚体，从而对下游药物代谢酶及转运体发挥重要调节作用。
经典诱导剂利福平被公认为是CYP3A4经PXR途径诱导的阳性参照药物，并已在多种细胞株中证实[11，12]。此外，大量体外实验证明外源性物质可通过PXR途径诱导CYP3A4酶活性，其中包括化学合成药物以及许多中药单体化合物。例如，Yangtisi等人用白当归素处理人原代肝细胞及Huh-7细胞系后发现CYP3A4的mRNA及蛋白水平均上升，进一步用突光报告基因实验证明这种改变与PXR诱导CYP酶活性有关。另有体内的群体药代动力学实验表明，改变PXR活性的63396 OT突变对经CYP3A4代谢的阿扎那韦血药浓度影响显著。
因此，我们建立细胞系内表达PXR的CYP3A4启动子的双焚光告基因平台，对多种中药单体化合物进行蹄选。并对筛选出的活性单体进行多剂量给药研究。
2材料与方法
2.1试剂和设备
HepG2细胞系为人肝癌细胞，釆用含10%胎牛血清的DMEM培养基于5%C02、37。C细胞培养箱内培养。培养3天后，弃去培基，PBS清洗两次后用0.25%胰酶（含0.01%EDTA)消化8分钟，吹打至基本呈单个细胞状态。待细胞贴壁后，24小时内换液。
(1)取分装的冻存感受态细菌于37°C水浴迅速解冻。取适量质粒分别加入感受态细菌混悬液中，用无菌枪头吹打混匀，置于冰上30分钟；
(2)将此EP管置于42°C水浴热激90秒，此过程中拒绝摇动试管。再将热激后的EP管迅速置于冰水浴上冷却1分钟；
(3)加入800 nL LB液体培养基至冷却后的菌液EP管内，水浴加温至37°C，将此EP管于摇菌箱中230 rpm, 37°C振荡培养1小时使细菌复苏；
(4)取此培养液用3000rpm室温离心10分钟，弃去上清，以200 fxLLB液体培养基重悬细菌；
(5)取适量体积细菌悬液以1:2，000的比例稀释后，用烧灼冷却后的涂布器均匀涂布于含氨节西林LB固体培养基平皿。把平皿置于37°C，待液体被完全吸收后，倒置平皿培养过夜。
取生长状态良好的HepG2细胞，消化传代，以2X106/孔的密度均匀分散的接种于6孔板。显微镜下观察待其贴壁后，弃去原先加入的完全培养基，以PBS清洗2遍后，加入不含胎牛血清及双抗的DMEM培养过夜。观察其生长状态，如细胞分散均匀，状态良好，汇合度达90%则可用于转染。根据lipofectamine 2000说明书中的推荐用量，每孔分别转入1 mg pcDNA3.1-rnyc/his B (-)空载体和1 mgpcDNA3.1-tnyc/his B (-)-hPXR质粒。转染6小时后，弃去转染含转染试剂的培基。PBS清洗后，加入喊抗生素及血清的完全培基，继续放入细胞箱培养。
取生长状态良好的HepG2细胞，消化传代，以IxlO5/孔的密度均匀分散的接种于24孔板。显微镜下观察待其贴壁后，弃去原先加入的完全培养基，以PBS清洗2遍后，加入不含胎牛血清及青霉素链霉素的DMEM培养过夜。观察其生长状态，如细胞分散均匀，状态良好，汇合度达80-90%则可用于转染。用适量不含抗生素和血清的细胞培养液分别稀释600 ng/?L PGL4.17-CYP3A4荧光报告基因质粒，100 ng/孔pcDNA3.1-hPXR质粒和20 ng/孔 pRL-TK内参质粒和2 nL/孔Lipofectamine 2000脂质体。轻轻混勾，.待完全溶解后将二者混合(Lipofectamine2000脂质体溶于培基后，此混合过程必须于20分钟内完成，否则将影响脂质体转运DNA的效果），将混合物室温放置20分钟，加入细胞孔板中，轻轻晃动孔板使均勾。转染6小时后，弃去含转染试剂的培基。
第二章冬凌草甲素对人源化hPXR小鼠肝脏CYP450I6mRNA表达及活性的影响
1研究背景
哺乳动物由于长期暴露于存在外源性有害化学物质的环境中，在漫长的进化过程中已演化出一套解毒机制来克服外源性化合物的潜在毒害作用。该机制主要涉及外源性物质代谢的三个阶段，分别称为I相代谢，II相代谢以及m相代谢。其中，I相代谢主要是CYP450超家族参与的外源性物质生物转化，主要包括氧化、去甲基化和水解反应。I相代谢的代谢场主要在肝脏也有部分在小肠和肺中进行I相代谢后，代谢产物可直接排出体外或者进一步参与II相代谢。II相代谢主要是结合反应主要是一些内源性结合物质如葡萄糖醛酸,磺酸基和谷胱甘肽等与I相代谢产物结合，增加其水溶性，从而更利于I相代谢产物排出体外。此外，转运体通常也会影响外源性化合物的生物利用度，分布和消除，因此药物被转运的过程也被称为m相代谢[39]。近年来，大量研究证实核受体孕留烧X受体(pregnane X receptor, PXR)作为重要的调控因子，参与了药物代谢三个阶段的调节。
本实验选用上述人源化hPXR小鼠作为实验平台，研究了不同剂量冬凌草甲素对核受体hPXR基因所调控的下游肝CYP450酶的影响。从而推测冬凌草甲素潜在的药物-药物相互作用风险，为其临床合理使用提供一定的理论依据。
2材料与方法
本动物实验由中南大学临床药理研究所伦理委员会批准。实验动物由谢文教授赠送，经中南大学医学遗传学国家重点实验室实验动物中心繁殖扩大后，词养于中南大学动物实验中心，词养环境符合中国国家标准《实验动物词养环境及设施》（GB14925-2001)。实验动物为雄性人源化hPXR小鼠（22±2.5g，8周龄）。所有小鼠饲养于温度为25 ±2°C，相对湿度70 ±10%，自动光控（昼夜各12小时）的标准清洁动物房内，可以自由采食和饮水。冬凌草甲素（0，25，50，100, 200mg/kg)每天灌胃给药1次，15天后麻醉处死。摘取肝脏，迅速置于液氮冷冻后转移入-80℃冰箱，le藏备用。处死的同时，摘眼球采血，将血液收集入1.5mLEP管内。4°C条件下，3000g离心15分钟，取血清，贮藏-80℃冰箱备用。
取人源化hPXR小鼠肝叶相同部位的一小块肝组织以冰预冷的生理盐水冲洗后，10%中性甲酸溶液固定后，石蜡包埋，切片。采用苏木素-伊红（H&E)染色，光学显微镜下观察肝脏病理组织学改变。肝脏病变的发病率从每个动物相同肝脏部分的组织学分析确定，并比较具有代表性的视野，根据文献[48]对肝脏病理学变化程度进行分级评估。
所有器械（眼科剪，研钵）经18℃高温烘烤6小时己到达灭RNA酶的目的。总RNA提取全过程所用的Ep管、Tip头都使用含DEPC浓度为0.1%的双蒸水水浸泡过夜，高压灭菌40分钟，置于60℃烤箱内烘干过夜，备用。准备保温瓶储存液氮。
为观察多剂量冬凌草甲素对人源化hPXR小鼠肝脏组织的影响，本实验采用了石蜡包埋H&E染色的方法对人源化hPXR小鼠肝脏的组织病理学改变进行观察。代表性视野如图3-1显示，其中A为对照组小鼠肝组织切片，B-E为不同剂量冬凌草甲素处理后的人源化hPXR小鼠肝组织切片。可以观察到冬凌草甲素处理组和对照组并无明显差异，二者肝组织均色泽鲜红，质地均匀，肝小叶中肝窦正常。肝细胞核质均勾，边缘清晰，无坏死或空泡变性，也无浸润件炎症的侵袭。
第三章冬凌草甲素在LS174T细胞系中对CYP450酶的影响............43
1研究背景....................47
2材料与方法....................48
2.1试剂和设备....................48
2.2工作液配制....................50
2.3细胞培养....................50
第四章冬凌草甲素对C57BL/6小鼠肝脏CYP450酶mRNA表达及活性的影响....63
1研究背景....................66
2材料与方法....................67
2.1试剂和设备....................67
2.2工作液配制....................69
2.3实验动物....................69
2.4组织病理学....................69
2.5血清生化学....................69
第四章冬凌草甲素对C57BLM小鼠肝脏CYP450酶mRNA表达及活性的影响
1研究背景
冬凌草甲素（Oridonin)为唇形科香荼菜属植物冬凌草中分离出的贝壳杉稀二蔽类物质，主要植物来源为唇形科Lamiaceae (或Labiatae)香荼菜属Isodon (或Rabdosia)植物毛叶香荼菜 iRabdosia rabdosia、、碎米桠(Rabdosia rubescens)^ 显脉叶香茶菜(Rabdosia nervosa)、延命草(Jsodonjaponicus)、道孚香茶菜(Rabdosiadowmis)、冬凌草(^Rabdosia rubescens)等的全草。其中，又以碎米桠(^Rabdosiarubescens)全草中的含量最为丰富。因其显著的抗肿瘤活性受到了广泛的关注。近年来，越来越多的证据表明冬凌草甲素能阻碍肿瘤进展，减轻肿瘤负荷，同时缓解癌症综合征，从而在一定程度上提高癌症患者的生存率。早在1976年，Fujita等人首次报道了冬凌草甲素具有显著的抗增殖活性，这一研究为此后冬凌草甲素的药理研究提供了思路和依据。目前，抑制肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡作为癌症治疗的有效治疗方法得到了普遍认可，而冬凌草甲素在阻滞细胞周期，促进凋亡与自睡方面都显示有较强的作用。但目前关于冬凌草甲素对CYP450酶的影响暂无报道，故当冬凌草甲素与其它治疗药物联合使用时是否存在潜在的药物-药物相互作用尚不清楚。因此，亟需相关实验研究其对相关CYP450酶的作用，为冬凌草甲素的合理使用提供一定的理论依据。
喃齿类动物因其与人类有着较为相似的进化背景和同源性基因，常被用作实验动物进行体内实验的研究。其中，小鼠已超越大鼠和其他啮齿动物种系，成为研究人类遗传学，生理学，疾病和代谢的首选动物模型。这主要是因为从生物学的角度看，小鼠疾病的发生与发展同人类较为类似，且小鼠体内存在大量与人类基因同源或同功的基因。人们普遍认为，同源基因是不同物种间具有相似表达，功能和表型的基因。有研究表明小鼠与人类在进化中存在84%的同源保守序列。在代谢方面，迄今为止已有约40对CYP450酶被证实在人类和小鼠体内存在相似的编码酶的氨基酸序列，提示二者具有类似的代谢功能。同时，小鼠动物实验模型中又以C57BL/6小鼠与人类的药物代谢酶和转运体有着较高的同源性，例如，人类CYP1A1、CYP1A2、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1 和 CYP3A4 与 C57BL/6 小鼠的 Cyplal、Cypla2、Cyp2c37、Cyp2d22Cyp2el和Cyp3aII为同源基因，其DNA相似度和氣基酸序列似度均在70%以上。目前，C57BL/6小鼠作为研究药物代谢酶的合理的模型，已被许多经典的药物代谢实验选为实验动物模型进行研究。
5.本章小结
一直以来，中药作为治疗药物或者营养补充剂被广泛的应用于临床治疗和日常生活中。同时,大量由服用中药所引起的药物-药物相互作用引起了人们越来越多的关注。随着研究的日益深入，大部分药物-药物相互作用经证实都是由体内CYP450酶活性的改变，从而引起药物代谢水平的变化，导致其疗效降低或毒性增加。目前，中药与其它治疗药物联合使用的安全性和有效性已有大量的研究。然而对于冬凌草甲素的相关研究较少，且其对CYP450酶影响的体内实验暂无报道。
在本研究中，采用雄性C57BL/6小鼠分别给予多剂量冬凌草甲素（0，25, 50，100和200 mg/kg)连续灌胃15天，观察C57BL/6小鼠主要Cyp酶的活性变化。组织病理学和血清学实验结果表明，冬凌草甲素对小鼠肝脏无明显损伤。C57BL/6小鼠对冬凌草甲素的最大口服耐受量至少可达到200 mg/kg。随后，我们采用Real time PCR法系统性的研究了不同剂量冬凌草甲素对各主要肝脏CYP450酶mRNA表达水平的影响。同时也对调控该酵的相关的核受体和CYP450酶的唯一电子供体POR的mRNA水平进行研究。进而，我们采用HPLC-MS/MS法对6种主要CYP450酶的经典探针底物的代谢率变化进行测定，从而判断冬凌草甲素处理组肝脏CYP450酶的活性变化。实验结果表明，冬凌草甲素可显著诱导各CYP450酶、相关核受体和POR的mRNA表达水平。代谢活性检测发现Cypla，2a，2c，2d，2e，和3a家族的活性也有所增加，此变化与mRNA表达水平升高相一致。
总所周知，同源基因在不同物种间的表达和功能是相似的。由于小鼠模型被证实其同源基因的功能与人类的极为相似，所以经常被用来作为研究人类基因的动物模型。例如，约占人肝CYP450酶蛋白总量的50%的人CYP3A4基因，其同源基因为小鼠Cyp3all基因。人体内CYP3A4参与催化的一些内源性底物以及某些外源性物质，如括黄曲霉毒素B1，环孢素A和尼莫地平的代谢转化。冬凌草甲素可诱导CypSaII的表达增加,提示其可能会导致由改变CYP3A4活性所引起的药物-药物相互作用，从而改变合用药物的治疗效果，甚至产生毒副作用。
参考文献（略）