绪论
自十九世纪初期起，蛋白质便成为了一类重要的药物，但由于制备技术的限制，当时的蛋白药物主要来源于动植物的提取。直到上世纪 70 年代，随着重组DNA 技术的发展，人们可以利用大肠杆菌 E.coli 来表达重组的蛋白质。相比提取法而言，重组表达技术更加稳定，而且大大降低了成本。到了 80 年代，FDA批准了用 E.coli 制备的胰岛素用于糖尿病的治疗，开启了重组蛋白药物发展的大门。从这以后，除 E.coli 外还有其他的表达宿主（如：酵母、真菌、昆虫细胞以及哺乳动物细胞）被开发应用于更多更复杂治疗性蛋白的重组表达，如单克隆抗体。
至今为止，已有超过 151 中重组的蛋白类药物被 FDA 或欧洲药监局批准用于临床治疗。在这些被批准的蛋白药物中，有大约 1/4 是利用 E.coli 来生产的[1]。这也说明 E.coli 是重组蛋白药物主要宿主之一。相比于其它生物表达宿主，E.coli仍是最有吸引力的，因为人们对其基因组特点已经有了很好的了解，同时也有很多成熟的克隆工具和表达系统。而且事实也证明了，E.coli 可以用于大量不同蛋白质的表达。同时，由于生长快，培养成本低，产量大，质量高，易于放大的特点，使 E.coli 非常适于工业化规模的生产。为了提高 E.coli 中重组蛋白质的表达量、可溶性并利于下游的纯化，通常会在目的蛋白的 N 端或 C 端加上融合蛋白标签，如 Trx，GST，DsbA，DsbC，His 等[2]。同时使用酵母或者哺乳动物细胞进行表达的蛋白也可以加上类似的标签蛋白如 His，Fc 等以利于蛋白的下游纯化。在蛋白制备的下游阶段，可以使用特定的蛋白酶来除去这些融合标签，已获得高纯度目的蛋白。
肠激酶是一种小肠粘膜上皮细胞分泌的双链丝氨酸蛋白酶。它在动物体内的主要功能是将胰蛋白酶原激活成为有活性的胰蛋白酶，从而激活胰腺分泌的其他酶原，包括：胰凝乳蛋白酶原，弹性蛋白酶原，羧肽酶原，以及一些脂酶原。因此，肠激酶在调节小肠内的蛋白质消化中扮演了关键角色。对于天生肠激酶基因缺陷的人，由于其体内的肠激酶活性较低或者无活性，通常会有吸收不良综合症和营养不良。
最近十五年来，有非常多的关于肠激酶的研究。到目前为止，人类已经分子克隆了多个物种的肠激酶，包括：牛[6]、猪[7]、人[8]、大鼠[9]、小鼠。这些研究提供了很多关于肠激酶结构及组成特点的信息，为进一步研究这一蛋白酶的分子特性开辟了新的方向。例如：肠激酶的氨基端重链被证明主要负责肠激酶的肠粘膜定位和对大分子底物（如胰蛋白酶原）的识别，而羧基端的轻链是肠激酶的催化功能区，负责肠激酶的主要活性]。此外，最近的研究已经成功解析了牛肠激酶轻链和人肠激酶轻链，为其近一部改造，提供了完整的结构基础。
肠激酶之所以一直受到人们重视，是因为其轻链具有独特的底物识别和酶解活性（可以特异性的识别多肽序列 Asp-Asp-Asp-Asp-Lys（D4K）并切断其羧基端的肽键）[13]。肠激酶轻链所展示出的高度特异性使得它成为了切割重组表达蛋白的最合适工具酶[14]。目前，重组的牛肠激酶轻链已经被广泛应用于大规模生物制药和生命科学的基础研究。包括白介素 1（IL-1）、人生长因子（GH）、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、人组织型纤维蛋白溶解酶原激活剂（tPA）等一系列药用蛋白的大规模制备都应用了肠激酶作为去除多余融合标签的工具。Gasparian 等人在 2003 成功表达了重组人肠激酶轻链，并且发现人肠激酶轻链对于D4K 这一识别序列的活性，要比其他物种来源的同类酶高出近 10 倍[15]。然而，重组人肠激酶轻链在原核表达系统中，是以包涵体形式存在，需要经过两轮的变复性过程，才能最终得到目的蛋白。而且，其较低的复性得率（小于 2%），大大增加了其使用成本，不利于大规模的利用这一效率更高的工具酶[16]。
对于增加蛋白的复性得率，目前主要有两种手段：首先，是改进蛋白的复性工艺，寻找最佳复性条件；再者，就是通过对蛋白进行修饰改造，优化其本身的结构特性，减少复性中多聚体的产生。在最近的一项关于脂肪酶（lipase）的研究中，研究人员发现脯氨酸的存在可以有效防止温度诱导的蛋白聚集[17]。分析原因是由于脯氨酸的引入，减少了变性过程中有聚集倾向的中间体的产生。基于这点，本研究提出了大胆的假设，即脯氨酸的引入可以在蛋白复性过程中减少聚集的发生，从而增加复性得率。本研究对重组人肠激酶轻链进行了突变改造，在合适位点引入了脯氨酸残基，最终该酶的复性得率提高了 9 倍（从 2%提高到了20%）；同时，通过工艺优化，简化了该酶的复性过程，使其便于放大以用于大规模生产。此外，引入脯氨酸也令重组人肠激酶的热稳定性得到了提高，扩大了其使用条件的范围。
第一部分 计算机辅助分子设计提高重组人肠激酶的复性得率和热稳定性
1.1 本章引言
蛋白质的复性是重组蛋白大规模表达中的一项重要技术。然而蛋白质的复性是一个非常复杂的过程，目前还没有一个明确的理论可以适用于所有的蛋白质折叠过程。因此，没有一个统一的方法可用于所有蛋白质的复性。而且不同的蛋白质，由于其结构的复杂性不同，其复性的难易程度也不相同。在蛋白质的复性过程中，除了复性条件的影响之外，其折叠过渡态，也就是中间体的性质也会影响其正确折叠。折叠过渡态的蛋白可能存在无数种可能的空间构象，其中构象不稳定的蛋白之间可能会相互作用，形成不可逆的蛋白多聚体，从而导致蛋白复性得率较低甚至失败。因此，从理论上来说，提高蛋白质折叠过渡态的稳定性，将会减少无活性多聚体的产生，促进蛋白的正确折叠。脯氨酸（Proline，Pro）作为唯一含有嘌呤环的氨基酸，其所在区域的构象往往比较固定。目前还未有报道表明通过引入脯氨酸残基来影响蛋白质的复性过程。因此，本研究设计通过在合适位点引入脯氨酸，提高蛋白复性过程中过渡态的结构刚性，减少中间体构象的可能性，从而降低有聚集倾向中间体的比例，使得蛋白质的复性得率得到提高。此外，脯氨酸的顺、反式异构体之间的能量差（energy barrier）也可能会影响蛋白的折叠和解折叠过程[23,24]。脯氨酸的异构化是一个比较相对缓慢的过程，可以在蛋白质复性的过程中引入一个额外的慢相过程，减少有聚集倾向的中间体的积累[17]。因此，脯氨酸残基的引入有可能可以防止复性过程中不成熟蛋白的聚集，促进复性得率的提高。
在另一方面，脯氨酸残基的构象熵是所有氨基酸中最低的，并且会限制肽链骨架键的转动[25]。通过点突变，将特定位点的氨基酸（Xaa）替换为脯氨酸后，可以有效地降低蛋白的构象熵，并使蛋白更加稳定[26,27]。因此，引入脯氨酸残基也可以增加蛋白的热稳定性。在本研究中，我们通过在蛋白的合适位点引入脯氨酸，在保证蛋白活性不受影响的前提下，来提高重组人肠激酶轻链的复性得率和热稳定性。
1.2 计算机辅助寻找突变位点
在过去的报道中，我们知道脯氨酸作为结构熵最高的氨基酸，其对于蛋白质的稳定性有一定的帮助。在很多研究中，人们通过定点突变，将脯氨酸引入到蛋白质中，来提高热稳定性。此外，我们还更具文献报道，推测脯氨酸的引入在一定程度上，会减少复性过程中多聚体产生的可能性[17]。虽然目前还无更多的证明，但我们希望通过本研究中对重组人肠激酶的突变研究，来对这一理论进行验证。因此，我们预测脯氨酸的引入可能可以在提高热稳定性的同时，提高蛋白的复性得率。
通常而言，突变位点的选择需要考虑 2 个因素。首先是氨基酸残基所处的空间位置。脯氨酸的结构特殊性对其所处的空间位置有了很大的限制。一般来说脯氨酸主要是位于结构的转角处或者一些不规则结构区。如果脯氨酸出现在不合适的位置，会对蛋白的结构造成很大的变化，极可能对蛋白质的活性造成影响。因此，在本研究中，我们使用分子结构模拟软件，分析了重组人肠激酶轻链的立体结构，选择最合适脯氨酸残基的位点作为初步候选突变点。其中，我们主要分析的是每个氨基酸残基的二面角和其所在的二级结构。脯氨酸的位置通常有其特定的二面角范围[26]。根据这一范围找到的氨基酸残基，在突变为脯氨酸后，对于蛋白的结构影响会相对较小。同时，脯氨酸通常出现在β转角或者无规则区，因此我们可以利用这些条件限制来缩小突变位点的选择范围，以避免突变对蛋白的活性特性造成影响。
结构变化，对蛋白整体的结构影响较小。同时，在柔性区引入脯氨酸，对于提高蛋白整体的刚性的可能性较高，因此比较容易找到合适的突变位点。分子动力学模拟（MDS）是利用计算机软件来模拟一定时间内分子结构变化的技术。它对于蛋白质的折叠、稳定性以及分子间作用的研究都有很大的帮助。在本研究中的分子动力学模拟的应用，主要目的就是为了寻找重组人肠激酶轻链的结构柔性区，从而找到最合适的脯氨酸突变位点。
第二部分 鳉鱼肠激酶轻链高特异性的结构基础研究............... 46
2.1 本章引言.............................................. 46
2.2 鳉鱼肠激酶轻链（mEPL）的制备 ......................... 47
2.2.1 实验材料 ......................................... 47
2.2.2 实验方法 .......................................... 48
第三部分 重组人肠激酶轻链的特异性改造及其在制药工业中的应用... 81
3.1 本章引言................................................ 81
3.2 重组人肠激酶的特异性改造 .............................. 82
3.2.1 实验材料 ............................................... 82
3.2.2 实验方法 ............................................. 83
3.2.3 实验结果 ............................................. 84
结论......................................................... 104
第三部分 重组人肠激酶轻链的特异性改造及其在制药工业中的应用
3.1 本章引言
构建新型肠激酶的目的是为了更好的为蛋白药物的工业化生产提供更佳的工具酶，因此在研究的最后，我们使用改造后的新型重组人肠激酶轻链（hEPL-new）对一种工具蛋白和一种蛋白药物进行了酶切实验，以此验证其工业化生产中的应用性。金黄色葡萄球菌蛋白 A（ProteinA）可以与抗体 Fc 段特异性结合，是抗体纯化中重要层析介质原料[33]。偶联了 ProteinA 的亲和层析填料，目前被广泛应用与各类抗体药物的大规模生产纯化[33, 34]。因此，Protein A 作为抗体生产的工具蛋白，其工业化生产是抗体药物生产的前提。本研究中，我们利用hEPL-new 对重组表达的融合蛋白 Trx-D4K-ProteinA 进行酶切，已达到去除融合标签的目的。另一方面，重组人白细胞介素-11（rhIL-11）是专门用于治疗化疗后血小板减少的细胞因子类药物[35]。目前，rhIL-11 的主要生产方式是由基因工程技术在大肠菌 E.coli 中重组表达[36]。本研究中，我们同样利用 hEPL-new 对重组表达的融合蛋白 Trx-D4K-rhIL-11 进行酶切，已达到去除融合标签的目的。
使用特异性荧光底物 GD4K-βNA 来检测 hEPL 及其突变体的酶活性。检测方法详见 2.5.2 部分。在 100 μl 的反应液中加入 19 nM 的 hEPL 或者突变体后，反应开始。对荧光响应值（λex= 337 nm， λem= 420 nm）连续检测 3 min，记录期间荧光数值的增加。使用双倒数作图法（Lineweaver-Burkplots）计算 Km 和 kcat。使用非特异性底物 Boc-E(OBzl)-AR-MCA 和 Z-FR-MCA 来检测 hEPL 及突变体的非特异酶活性[22]。检测详细方法见 2.5.2 部分。在 100 μl 的反应液中加入 hEPL（终浓度 1.9nM），开始反应。对荧光响应值（λex=380nm andλem= 460nm）连续检测 3 min。使用双倒数作图法（Lineweaver-Burk plots）计算 Km 和kcat。
酶动力学结果显示，突变体 hEPL(K62P/K101P)-L24H、Y136E、L213R、E136Y/ R213L 和 L24H/Y136E/L213R 对非特异性底物的酶切效率均比野生型要低（表 3.1）。但是除 L24H 外，其它所有的突变均也会同时造成酶对特异性底物 GD4K-βNA 的酶切效率下降。对于 Y136E 和 L213R 两个突变而言，任何一个突变均可能造成固有的空间结构破坏，尤其是 Y136E，以一个带负电的侧链替换一个芳香环侧链后，局部的空间结构及带电性会发生明显的变化，尤其是所带的负电荷，会直接影响酶与底物（DDDDK）的接近，从而降低了酶切活性。此外，从不同突变体对不同底物的酶活变化看来，24,136，和 213 这三个位点的氨基酸对于 hEPL 的活性影响十分显著，这也暗示了酶活性中心疏水口袋的组成对于酶与底物的可接近性密切相关。
结论
1.通过突变改造，大幅度提高了重组人肠激酶的复性得率
创新性地将脯氨酸置换法应用到了蛋白质的复性当中。本研究通过蛋白结构分析并结合分子动力学模拟，寻找到了人肠激酶轻链（hEPL）中合适引入脯氨酸的残基位点，经突变实验发现点突变 K62P 和 K101P 分别可以将 hEPL 的复性得率提高 2 倍和 5 倍。联合突变实验表明突变体 k62P/K101P 的复性得率是野生型的10 倍。这些实验结果表明，该研究策略可以有效地提高蛋白质的复性得率。创新性优化了 hEPL 的纯化工艺。利用稀释复性法，通过优化变复性的条件，大大减少了复性过程的步骤，避免了昂贵试剂的使用，使整个下游纯化工艺更简单、经济。由于操作的复杂性较低，该工艺容易放大规模，用于工业生产。
2. 提高了重组人肠激酶的热稳定性
首次将分子动力学模拟技术应用到 hEPL 热稳定性的研究中。对 hEPL 进行了分子动力学模拟，发现区段 61~73，99~108，112~125 处的氨基酸不稳定，选择其内或附近的残基作为靶点设计突变体，分子动力学模拟结果表明突变体 K62P、K101P 和 E116P 均可提高 hEPL 中区段 112~125 的构象稳定性。体外实验表明突变体 K62P、K101P 和 E116P 的 T50分别较野生型提高了 1.1℃、4.7℃和 3.7℃。
3. 首次结晶出了鱂鱼肠激酶轻链（mEPL）的晶体
首次结晶出了 mEPL 的晶体，通过分子置换法（MR）首次解析了 mEPL 晶体，为典型的 α/β 胰蛋白酶样结构，分辨率达到 2.0 。结果显示，每个不对称单位中，有两个 mEPL 分子。
4. 首次明确了 mEPL 的活性和特异性的结构基础
通过比对 mEPL 和 bEPL 以及 hEPL 的酶活性中心区，发现 mEPL 的催化活性机制与 bEPL 类似，为典型的催化三联体（H41-D92-S187）反应机理。结构对比显示，三者的骨架结构相似度极高，但是在 mEPL 存在额外的两对相互作用（H24-G185，E136-R213），可能是 mEPL 高特异性的原因。体外实验表明突变体 mEPL-H24L 和 mEPL-E136Y/R213L 的特异性均有所下降，证明了这三个残基对 mEPL 酶活特异性的重要性。
5. 首次通过定向突变提高了 hEPL 的特异性
在对 mEPL 结构研究的基础上，将影响特异性的关键氨基酸通过定点突变引入 hEPL(K62P/K101P)。活性检测实验表明突变体 hEPL(K62P/K101P)-Q24H 可以在保证酶活性不降低的基础上，提升 hEPL 的特异性。因此，在实际应用中，高特异的酶可以有效避免非特异性的酶切活性，减少副产物的产生。
参考文献（略）