4种地衣多糖的生物活性和分离纯化研究

第一章植物多糖结构特征与生物活性研究概况

第一节植物多糖
多糖是由单糖之间脱水形成糖若键，并以糖苷键线性或分支连接成的链状聚合物，是具有广泛生物活性的生物大分子物质，又称多聚糖。作为来自高等植物、动物细胞膜和微生物细胞壁中的天然高分子化合物，它是维持生命活动正常运转的基本物质之一。多糖具有突出的生物活性且其毒副作用少，因而成为生命科学研究领域热点追捧的对象。多糖的广泛药理活性与维持生命各项活动都息息相关，在发挥抗肿瘤、抗氧化、抗感染、抗病毒、降血糖以及抗衰老等作用方面效果显著，有些可作为或已经成为治疗疾病的药物用于临床。作为多糖主要来源的植物多糖，已有一大部分研究的比较成熟，研究内容包括分离纯化、药理活性、结构特征等，但更多的研究正在如火如荼的进行中。研究比较成熟的植物多糖有枸杞多糖、黄精多糖、甘草多糖等[1]。
1结构特征研究
对大量植物多糖进行研究发现，其主要成分为Glc、Xyl、Man、Gal、Fuc、Fm、Ara、Rha、GlcA等，相对分子质量从几万到百万以上。这些种单糖以一定的比例聚合，从而形成成千上万种结构各异的植物多糖。单糖是构成植物多糖基本结构单位，它们以糖苦键连成直链或支链，糖苷键常见的类型有a-1,4、P-l，3、p-1,4和a-l，6苷键，直链一般以a-1,4-苗键和p-l，4-苦键连成，支链以a-1,6-苦键连接。
多糖和蛋白质一样，也有一、二、三、四级结构之分，其结构和生物活性有着密切的关系。多糖的一级结构为初级结构，糖基上可以通过连接磷酸基团、甲基化基团、硫酸基团等功能团，使一级结构变得复杂。二、三、四级结构为高级结构，它是以一级结构为根本，各侧链通过非共价键相互作用联合而形成繁杂的高级结构[3]。

多糖的组成研究与结构分析，常用方法有化学方法和仪器分析方法，而仪器分析方法以其分辨率高、灵敏度好的优点而被普遍釆用。而目分析多糖高级结构主要采用光谱学方法，诸如2D-核磁共振、原子力显微镜、X-射线衍射、圆二色谱法等，以及依赖于计算机的分子模型法[4]。迄今对于多糖结构的报导，大多停留在一级结构的测定，对高级结构的研究少之又少，这也直接表明了多糖的高级结构研究的举步维艰。对于多糖糖链的结构的研究，主要包括纯度检测，相对分子质量确定，单糖构成分析，糖连接位置测定，糖苷键构型及氧环的研究，糖链连接次序的测定[5]。
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第二节菌藻类多糖
菌类和藻类均属于低等植物，最近十几年，从燕菌类、藻类、地衣类等植物中提取的具有广谱治疗作用及相对低毒的多糖，在生物医学领域引起了极大关注，真菌多糖占其中很大的比例。真菌多糖是自然界中生物活性突出、品种众多的一类植物多糖，主要分布于真菌子实体、菌丝体、发酵液中。活性多糖作为生物效应调节剂，能够控制细胞分裂分化、调节细胞生长衰老，主要影响和介导机体的免疫系统，发挥抗肿瘤、抗病毒、抗炎、抗凝血、降血脂、血糖等作用[57_58]。海藻是存在于海洋中的一类低等植物，是海洋中有机物的原始缔造者和无机物的天然富集者。海藻中的活性物质主要由小分子物质和海藻多糖组成，多糖是其中主要组成部分，具有很大的利用价值。药理研究表明，海藻多糖具有抗肿瘤、抗病毒、抗心血管疾病等活性[59]。近年来，越来越多的学者将目光聚集于海藻多糖生物活性的研究，使其成为目前海洋生物研究中最为活跃的领域之一。
1结构特征
真菌多糖是具有螺旋状三维立体结构的复杂多糖，其结构有初级和高级之分，目前的研究主要集中在初级结构。初级结构真菌多糖主要有葡聚糖、甘露聚糖、杂多糖、糖蛋白和多糖肽等几种类型。高级结构包括骨架链间以氛键结合形成的各种聚合体、聚合体盘曲折叠而形成的空间构象、多聚链间非共价键结合形成的聚合体。

活性多糖的高级结构分为A、B、C、D型4种：A型为可拉型带状，B型为屈曲状螺旋，C型为皱纹型带状，D型为屈曲状线图。具有B型结构的多糖在增强免疫功能方面作用突出，A型活性不显著，C和D型一般不显示任何活性。灵芝多糖、山茱萸多糖、党参多糖等均属于B型结构[61]。
2生物活性
真菌多糖具有三维立体结构，这与同样具有三维立体结构的DNA很相似，是以P糖苦键连接的多糖。由于人体内缺少P淀粉酶，所以真菌多糖在体内不能直接被消化分解以及吸收，但可以通过结合细胞膜上的受体，来发挥药理活性。因此，真菌多糖是一类活性突出的大分子物质。藻类多糖是一种细胞间粘性多糖，很难被消化吸收，是海藻中最主要的活性物质。
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第二章4种地衣多糖提取工艺和纯化工艺研究

多糖的来源广泛，不同来源的多糖提取方法各不相同。大多数真菌多糖可溶于热水，加入乙醇等有机溶剂可形成絮状沉淀，因此水提醇沉法是目前最常用的提取真菌多糖的方法。热水回流法提取多糖，影响多糖提取率的因素通常有提取温度、提取次数、回流时间、料液比等。采用热水提取得到的粗多糖大多含有蛋白质、色素等杂质，蛋白质的脱除常釆用使蛋白质沉淀而多糖不沉淀的化学试剂来处理，如氯仿、三氯乙酸、鞣酸等。色素的去除则釆用能吸附色素而不吸附多糖的介质，如活性炭、树脂等。本实验釆用热水回流法提取4种地衣多糖，利用单因素实验结合中心组合实验设计考察了回流温度、提取时间、料液比对多糖提取率的影响，确定了最佳提取工艺，并比较了3种常用脱蛋白和脱色方法，得出了适宜4种地衣多糖的最佳脱蛋白和脱色方法，为下一步的分离纯化奠定了基础。

第一节4种地衣多糖提取工艺的研究
1材料与仪器
1.1材料与试剂

4种药用地衣材料均采自太白山，经西北大学王玛丽教授鉴定，太白茶为不完全地衣类植物雪地茶subuliformis (Ehrh.) W. Culb.的枝状体；金刷把为梅衣科植物金丝刷Lethariellacladonioides (Nyl.) Krog的枝状体；黑石耳为皮果衣科植物裂叶石耳tornata (Ach.) Del.的叶状体；红石耳为石耳科植物红腹石耳 Umbilicaria hypococcinea (Jatta) Llano 的叶状体。
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第二节4种地衣多糖脱蛋白和脱色工艺的优化
由于金刷把、黑石耳、红石耳、太白茶本身的特性，以及本次实验釆取水提醇沉法作为多糖的粗提方法，导致大量的杂质，如蛋白质、色素等也随粗多糖一起被提出。这些杂质会吸附部分多糖，增加粗多糖分离的难度，因此，在纯化过程中脱蛋白和脱色是非常关键的步骤。
1材料与仪器
1.1材料与试剂

1. 2主要仪器
主要仪器参见第一节1.2。
2实验方法
2.1脱蛋白方法旳比较
本实验以脱蛋白率和多糖损失率为指标，比较了 Sevag法、酶+Sevag法以及TCA+Sevag法对4种地衣多糖的脱蛋白效果，确定适合4种地衣多糖的最佳脱蛋白方法。
Sevag法：参考文献，取4种地衣多糖提取物，制成一定浓度的水溶液，加入多糖体积1/5的氯仿以及氯仿体积1/5的正丁醇，混匀，剧烈震荡，分离水层与有机层交界处的变性蛋白，反复多次，直至交界处无白色物质产生。
酶+Sevag法：参考文献[129]，取4种地衣多糖提取物，制成一定浓度的水溶液，加入3%胃蛋白酶液进行酶解，于42°C水浴过夜，酶解液采用Sevag法步骤脱蛋白3次，直至交界层无蛋白析出。
TCA+Sevag法：参考文献，取4种地衣多糖提取物，制成一定浓度的水溶液，滴加三氯乙酸溶液，使其终浓度为3%，静置过夜，除去沉淀。上清液采用Sevag法步骤脱蛋白，直至交界层无蛋白析出。
蛋白质含量测定：釆用考马斯亮蓝法[131]，以牛血清蛋白为对照品做标准曲线。
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第三章4种地衣多糖的分离纯化及结构特征初步研究................................. 46
1材料与仪器................................. 46
1.1材料与试剂................................. 46
1.2主要仪器................................. 47
2 实验方法................................. 47
2.1多糖分离纯化................................. 47
2.2多糖纯度和分子量的测定................................. 47
2.3红外光谱分析................................. 48
2.4多糖含量、糖醛酸含量测定................................. 48
2.5单糖组成分析................................. 48
3结果与分析................................. 49
3.1分离纯化结果................................. 49
3.2纯度和分子量测定结果................................. 53
3.3红外扫描结果................................. 56
3.4多糖含量、糖醛酸含量测定结果................................. 61
3.5单糖组成分析结果................................. 62
4 小结................................. 66

第四章地衣多糖生物活性研究
多糖具有广泛的生物活性，作为重要的活性物质已有大量多糖制品应用于临床。研究发现多糖及糖蛋白在一定程度上参与介导机体细胞的各种生命现象，尤其在抑制肿瘤生长方面发挥了突出的疗效，由于其来源丰富，低毒副作用等优点，因而成为开发新型抗癌药物的首选目标。因此，本研究在细胞水平上，以乳腺癌细胞MCF-7、Hela细胞、肝癌细胞Hep G2、结肠癌细胞Caco2、胃癌细胞SGC7901、黑色素瘤细胞A375为靴细胞模型，采用MTT法对4种地衣粗多糖及分离纯化所得8种多糖组分抗肿瘤活性进行初步的蹄选，诣在发现具有显著抗肿瘤活性的组分加以进一步研究。
大量研究表明，许多重大疾病如癌症、心血管疾病等都与活性氧自由基过剩导致的氧化损伤有直接的联系，尤其是轻基自由基、超氧阴离子自由基、脂质自由基等的过剩。自由基在机体内有双重的作用，正常生理情况下，活性氧自由基的产生与维持机体新陈代谢处于平衡状态。病理状态下，自由基的产生大于机体对其的利用时，就会造成自由基的堆积，过剩的自由基会对机体产生氧化损伤，从而引发多种疾病。为了避免由于氧化损伤引发的疾病，开发高效、低毒的抗氧化剂变得尤为重要，植物多糖具有较好的抗氧化性，因此本文对4种地衣粗多糖及分离纯化所得8种多糖组分的抗氧化性进行了考察，以期为天然抗氧化剂的开发做贡献。

第一节抗肿瘤活性研究
1材料与仪器
1.1材料与试剂


1.2主要仪器
主要仪器参见第二章。
2实验方法
2.1细胞培养
本实验研究不同浓度的多糖组分对Hela细胞、肝癌Hep G2细胞、乳腺癌MCF-7细胞、结肠癌Caco2、胃癌SGC7901细胞、黑色素瘤A375细胞的增殖抑制作用。将受试细胞在371、5% C02及饱和湿度的条件下常规培养。
2.2 MTT法试验
收集对数生长期细胞，调整细胞密度为5×107/L,接种于96孔板，每孔200μL。常规条件恒温培养24h后，待细胞贴壁，换液，设置空白组和实验组，实验组多糖样品溶液，使最终质量浓度分别为10、50、100、200、400、SOO^ig/mL,恒温培养48h后，加入新配制的MTT溶液(5g/L)，恒温解育4h,以150jiLDMSO溶解生成的有色物质，于490nm处用酶标仪测定样品吸光值(A)。细胞抑制率=(1-实验组A值/空白组A值)X 100％。
3结果与分析
不同浓度金刷把、黑石耳、红石耳、太白茶粗多糖及纯化多糖组分对人Hela细胞、肝癌Hep G2细胞、乳腺癌MCF-7细胞、结肠癌Caco2、胃癌SGC7901细胞、黑色素瘤A375细胞增殖抑制作用，采用抑制率表示，抑制率为正值表示增殖抑制，为负值表示增殖促进，ICso值表示整体抑制作用的大小，ICso值越小，抑制作用越强。
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第五章结论与展望

1结论
1.1优化了金刷把、黑石耳、红石耳、太白茶4种地衣粗多糖的热水回流提取工艺，得出了 4种地衣粗多糖的最佳提取方法；比较了 3种多糖常用脱蛋白方法及脱色方法，得到了适宜金刷把、黑石耳、红石耳、太白茶4种地衣粗多糖的脱蛋白和脱色工艺。
1.2经过柱层析对4种地衣粗多糖分离纯化，JSB分离为JSB-1和JSB-;2, HEI分离为HEI-1和HEI-2，HSE分离为HSE-1和HSE-;2, TBC分离为TBC-1和TBC-2。经过3种纯度检测方法测定，上述8种纯化多糖均为单一组分，不含蛋白质和色素。
1.3 JSB-1、JSB-2、HEI-1、HEI-2、HSE-1、HSE-2、TBC-1、TBC-2 均表现出口比喃糖的特征吸收，其中JSB-1是含有a糖苦键的化合物，HEI-l、HSE-l、TBC-2是含有糖苷键的化合物。
1.4 JSB-1、JSB-2、HEI-1、HEI-2、HSE-1、HSE-2、TBC-K TBC-2 分子量分别为 24437.68、11222.32、79432.82、28658.04、10566.12、8367.58、13197.77、9284.22； JSB-1、JSB-2、HEI-1、HEI-2、HSE-1、HSE-2 都主要由 Man 和 Glc组成，其中 HSE-2 种含有少量的 GlcA，TBC-1 由 Ara、Xyl、Man、Glc、Gal组成，TBC-2 由 Man、Glc、Gal 组成。
1.5 通过测试 JSB、JSB-1、JSB-2> HEI、HEI-1、HEI-2> HSE、HSE-1、HSE-2、TBC、TBC-1、TBC-2对6种肿瘤细胞增殖的影响，发现JSB、JSB-1、JSB-2、HEI、HEI-1、HEI-2、HSE、HSE-1对Hela细胞的增殖抑制效果最好，HSE-2、TBC、TBC-1、TBC-2则对Hep G2细胞表现出了良好的增殖抑制作用；通过3种抗氧化方法的综合评价，表明JSB、JSB-1、JSB-2、HEI、HEI-1、HEI-2、HSE、HSE-1、HSE-2、TBC、TBC-1、TBC-2均有较好的抗氧化活性，且在一定范围抗氧化活性与多糖浓度呈现良好的量效关系。
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参考文献（略）