氨甲环酸柔性纳米脂质体凝胶的制作和体外释药分析

第一章绪论

皮肤色素沉着是临床上皮肤科常见的病症之一，它是由于皮肤受到紫外线照射、炎症刺激等外源性因素和自身疾病引起的内源性因素使大量黑色素非正常聚集于皮肤的不同部位，在皮肤表面呈现出局部颜色变黑，如黑斑息肉综合征、特发性多发性斑状色素沉着、黄褐斑、雀斑、色斑及老年斑等[1]。皮肤色素沉着类疾病尽管没有疼痛、瘙痒等痛苦，但由于黑色素沉着导致的皮肤肤色不均，进而影响到人们的日常生活。随着社会的发展，抗色素沉着类疾病引起了人们的关注，从而出现了各式各样祛斑产品和治疗方法[5]。
氨甲环酸(TranexamicAcid，TA)作为一种蛋白酶抑制剂，抑制黑斑部位表皮细胞的机能，改善黑斑部位活性化因子群的活跃状态[6]，抑制黑色素的生产而被应用于治疗色素沉着等病症。目前临床上使用TA治疗色素沉着疾病多是口服或静脉注射给药，常引起胃肠道刺激等不良反应[7_8]。经查阅文献的得知：TA作为经皮给药制剂的主要剂型是膏剂，然而因皮肤角质层这一主要的物理屏障，疗效不显著。
近年来，在新技术和新设备不断发展的情况下，关于经皮给药系统在促进药物透皮吸收的方法方面取得了很大的进步[9]。微乳[iG]、固体脂质纳米粒[11]、脂质体[12]等新型药物载体可与角皮肤质层具有很高的融合性，从而将药物传递到皮肤内部来克服皮肤角质层屏障的影响。柔性纳米脂质体(Flexible nano-liposomes，FNL)是在脂质体的类脂材料中加入胆酸钠、脱氧胆酸钠等表面活性剂，使其除具有普通脂质体经皮给药系统的优点如生物利用度高、皮肤亲和力好和安全无毒外，还具有高度的变形性、适宜的亲水性和渗透性[13]。因此能够高效地穿透比自身小数倍的皮肤孔道。此外，柔性纳米脂质体的结构类似于生物膜结构，与皮肤角质层具有很高的融合性，可以使药物尽可能多地在皮肤的表皮和真皮层内形成一个药物e库，而发挥其缓释效果，使药物能够在局部病变部位持久地起治疗作用。
然而FNL作为液体制剂，在经皮给药时存在着粘附性差、不易在皮肤上保留的问题，因此考虑将其制备成半固体制剂。而凝胶剂作为一种新型的生物粘附制剂，容易涂抹，因其水溶性易于洗搽，近年来正成为皮肤外用制剂的发展方向[14]。
综上所述，本研究将氨甲环酸制成柔性纳米脂质体再与凝胶技术相结合[15]，使氨甲环酸柔性纳米脂质体分布于凝胶中，作为一种新的经皮给药载体，不仅使用方便，而且增加了柔性纳米脂质体的稳定性。

1.1氨甲环酸的研究概况
1.1.1氨甲环酸的简介
氨甲环酸又称传明酸，止血环酸，凝血酸，氨甲基环己甲酸。分子式为C8H15N02,分子量为157.21，其化学结构式为对氨甲基环己焼豫基，是赖氨酸合成衍生物[7]。是日本专家罔本，横井等于1954年发现的，作为合成的氨基类抗纤溶止血药己有50多年的临床使用经验，国内最早是由天津医工院与洞庭制药在1968年联合研制，多国药典都有收载记录[16]。
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1.2柔性纳米脂质体的研究现状
1.2.1柔性纳米脂质体概念及特点
柔性纳米脂质体又称传递体（transfersomes)或变形脂质体，是一种新型的经皮给药载体[48]。是1992年Gevc等在研究局部止痛药和局部麻醉药脂质体时，首次提出将表面活性剂加入到脂质膜材料中，而使脂质体具有了高度的变形性。因此与常规脂质体相比，FNL是一种具有高度变形性的脂质囊泡，可以穿过是其自身直径1/5的微孔，且FNL的直径在此前后并无太大的变化。这是由于组成FNL磷脂聚合的不均勻性，及表面活性剂使类脂材料在高曲折区聚集，从而降低了 FNL在变形过程中需要克服的表面弹性能。
柔性纳米脂质体经皮渗透的动力主要是皮肤两侧的水浓度差。当非封闭地在皮肤表面给予一定量的FNL时，由于水分的蒸发导致局部脱水，因FNL的高度亲水性和渗透性，它就会渗透到含水更丰富或更深层的皮肤组织当中，在渗透梯度和水合力的双层作用下，FNL凭借它高度的变形性透过皮肤角质层细胞间隙。这就是目前被众多学者所认可的FNL的透皮机制，即渗透梯度和水合力理论[50]。
1.2.2柔性纳米脂质体的制备方法
1.2.2.1机械分散法
先用有机溶剂溶解类脂材料与脂溶性药物，再除去有机溶剂，使其在瓶壁上形成一层膜；加入药物水溶液，室温放置使脂质水化，再在高于类脂相变温度下使脂质薄膜分散，使其吸水膨胀形成脂质体。此法制备的脂质体多为多层脂质体。如薄膜分散法，冷冻干燥法。
薄膜分散法是将憐脂、胆固醇等脂质膜材料和脂溶性药物溶于有机溶剂中，再将有机溶剂蒸发掉，使其在瓶壁上形成一层薄膜；或将溶有水溶性药物的磷酸盐缓冲液加入，不断搅拌，得到脂质体悬浮液，此法只适用于脂溶性药物及水溶性较低的药物。牛瑞[53]等人釆用薄膜超声分散法制备了包封率可达58.39%的抗氧化钛柔性纳米脂质体。Ricci .M[54]等对比了水溶性多肽类药物-硫酸卷曲霉素脂质体的两种制备方法（冻融法和薄膜分散法），结果显示冻融法制备的脂质体包封率明显高于薄膜分散法的，且随着冻融次数的增加，脂质体的粒径也随着增加[55]。
1.2.2.2溶剂分散法[52]
此法是将类脂材料先溶于有机溶剂中，再加入到药物的水相中，使脂质材料以单分子层的形式在有机相和水相的交界面上排列，如逆向旋蒸法、复乳法和注入法。
逆向旋蒸法是将脂质膜材料溶于有机溶剂（氯仿、乙醚等）中，再加入溶解药物和表面活性剂的水溶液，经过超声处理，直到形成稳定的油包水型乳状液，再旋转蒸发除去有机溶剂，达到胶状后滴加缓冲液，水化，继续减压蒸发得到脂质体混悬液，然而这种方法只适宜包裹水溶性药物和大分子生物活性物质，如朱林[56]等人采用此法将水溶性药物甲氨蝶呤制成柔性纳米脂质体时，得到包封率大于60%的脂质体。
注入法是先将脂质膜材料和脂溶性药物溶于有机溶剂中，然后经注射器将此药物溶液缓慢注入磷酸盐缓冲液中，再将有机溶剂挥发完全，即得纳米脂质体混悬液。此法又分为乙醇注入法和乙醚注入法[52]。
其他制备方法，用物理方法改变脂质体粒径的大小，如微囊化法、超声法[57]、薄膜挤压法、主动载药法[58]等。其次还有两种方法的联合使用，如胡鹏翼[59]等采用pH梯度结合逆向旋蒸法将弱碱性药物槐定碱制成纳米脂质体，得到柔性纳米脂质体的包封率为(90.3±0.63)%，粒径为(117±6) nm。
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第二章氨甲环酸处方前研究

本章进行TA-FNL的处方前研究，首先对TA检测方法的建立；其次是对TA理化性质进行研究，主要包括平衡溶解度和油水分配系数；最后TA-FNL评价指标方法的建立；为TA-FNL的制备提供依据。

2.1材料与仪器
2.1.1仪器
YP-5001电子精密天平(上海良平仪器仪表有限公司)；LC-20AT型高效液相色谱仪(円本岛津公司)；紫外分光光度计（FI本Shimadzu公司）；SK1200H超声仪(上海科导超声仪器有限公司)；QL-901祸旋仪(海门市齐林贝尔仪器制造有限公司)；79-1型恒温磁力加热搅拌器(山东省諷诚光明仪器有限公司)。JEM-2000EX透射电子显微镜（R本电子公司）；激光动态散射Zeta-sizemanos ZEN3600 (英国Malvem公司）；RE-52AA旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；SHZ-D(III)型循环水式真空菜（巩义市予华仪器有限责任公司）；FY-200高压匀质机（上海仪器厂）；透析袋（截留相对分子质量14000,美国联合碳化物公司）；恒温箱（上海跃进医疗器械厂）；冰箱（宁波万空小天使电器有限公司）；pH酸度仪（大普仪器）；NDJ-4型旋转式粘度计（上海昌吉地质仪器有限公司）。
2.1.2试药
TA对照品（中国药品生物制品检定所，批号：100174-201203）；TA原料药（质量分数99.9%，扬子江药业集团，批号20070103）色谱甲醇（Sigma公司，色谱纯）；十二烧基硫酸钠（天津市福晨化学试剂，批号：20080319）;正辛醇（天津市登峰化学试剂厂，批号20110920);憐酸氧二钠、憐酸二氢钠、三乙醇胺、甘油（天津市河东区红岩试剂厂）；磷酸(天津市化学试剂厂)；0.22 nm微孔滤膜(上海新亚药业有限公司)；三氯甲焼、大豆卵憐脂、胆固醇(天津博迪化工有限责任公司)；脱氧胆酸钠（北京奥博星生物技术有限责任公司，批号20080204）；三乙胺（天津市天力化学试剂有限公司）；卡波姆（成都市科龙化工试剂厂）；氮酮（丙城县东泰中间体有限公司，批号20120611）;辛夷挥发油（河南省召县华龙辛夷有限责任公司，批号20101220）；生理盐水（西安京西双鹤药业有限公司）；2,4-二破基氯苯（Sigma公司）；水为纯净水；其他辅助试剂均为分析纯。
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2.2方法与结果
2.2.1氨甲环酸分析方法的建立
2.2.1.1 TA检测波长的选择
称取一定量TA试药，置于10ml容量瓶中，加水溶解并稀释至容量瓶刻度，以相应的水为空白对照，在200?600nm波长范围内测定TA的紫外吸收值。TA紫外扫描图见 2-1。

经查阅文献得知TA的检测波长不一，有220nm[68]、210nm[70]，而《中国药典》「1]以220nm作为TA的检测波长，本文对TA原料药紫外扫描发现，它在220nm处有最大吸收，故将其作为本文TA的检测波长。
2.2.1.2色谱条件
色谱柱：C18 (4.6mm x 250mm,5|j,m)
流动相[73]: 0.23%十二焼基硫酸钠溶液（取18.3g无水憐酸二氧钠，溶于800mL水中，加8.3mL三乙胺混匀后，再加2.3g十二焼基硫酸钠，溶解完全后，用憐酸调节pH值至2.5，再用水稀释至lOOOmL,即得）-甲醇(45:55)
2.2.1.3溶液的配制[72]
TA对照品储备液：精密称取TA对照品25mg,置于5mL容量瓶内，用水溶解并定容至刻度，得到质量浓度为5mg/mL的储备液。
供试品溶液：吸取TA-FNL混悬液0.5mL置于10mL容量瓶内，用适量的脂质体消解液超声处理15min后，定容至容量瓶刻度，即得。
空白对照液：吸取空白FNL混悬液0.5mL后同供试品配制方法。
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第三章氨甲环酸柔性脂质体处方及制备工艺研究.................................... 16
3.1材料与仪器.................................... 16
3.2方法与结果.................................... 16
3.2.2处方与工艺的筛选.................................... 16
3.2.3氨甲环酸柔性纳米脂质体质量评价[86].................................... 28
3.2.4稳定性研究 303.2.5体外释放度实验.................................... 33
3.3讨论.................................... 34
3.4 小结.................................... 35
第四章氨甲环酸柔性纳米脂质体凝胶的制备.................................... 36
4.1材料与仪器.................................... 36
4.2方法与结果.................................... 36
4.2.1氨甲环酸凝胶的制备[87-88] .................................... 36
4.2.2氨甲环酸凝胶剂的体外经皮渗透实验[89].................................... 36
4.2.3凝胶处方的筛选[76].................................... 37
4.2.4氨甲环酸柔性纳米脂质体凝胶的透皮性能[68].................................... 41
4.2.5氨甲环酸柔性纳米脂质体凝胶的处方确定.................................... 41
4.3讨论.................................... 42
4.4本章小结.................................... 42
第五章氨甲环酸柔性纳米脂质体凝胶质量研究.................................... 43
5.1仪器与材料.................................... 43
5.2实验方法与结果 ....................................43
5.2.1样品配制.................................... 43
5.2.2氨甲环酸柔性纳米脂质体凝胶样品中氨甲环酸的含量测定.................................... 44
5.2.3 质量检查[76-104].................................... 44
5.2.4体外释放性质考察[73].................................... 46
5.2.5稳定性实验.................................... 46
5.3 讨论.................................... 48
5.4本章小结.................................... 48

第六章氨甲环酸柔性纳米脂质体凝胶的安全性评价

安全性评价是研制药物时要面临的首要问题，首先进行微生物检测；其次根据经皮给药系统的毒理学研究要求，本实验釆用小鼠、膝鼠作为研究对象，通过皮肤急性毒性.实验、皮肤刺激试验、皮肤过敏试验考察其安全性。

6.1材料与仪器
同“2.1”项。

6.2方法与结果
6.2.1急性毒性实验[13]
取昆明小鼠50只，随机分成5组，即正常组，完整皮肤组和破损皮肤组各两个剂量组。于实验前24h，采用8%硫化钠溶液脱毛，脱毛范围：背部脊椎两侧左、右各1.5crnx2cm,受伤的皮肤不易做完整皮肤组的毒性试验。分别对受试动物完整皮肤组，均勾涂抹高、低剂量的TA-FNL凝胶和空白凝胶（对照组4g/只，试药高剂量组4g/只，低剂量组2 g/只）。破损皮肤组的制备方法：采用消毒后的刀片划破受试小鼠的脱毛区，以渗血为宜，按完整皮肤组的给药方式涂抹药物。24h后用温水将皮肤上凝胶洗干净，继续将各组小鼠喂养一周，观察并记录小鼠的死亡情况及体重变化。结果没有出现死亡现象，各组小鼠体重变化见表6-1。

6.2.2皮肤刺激试验[72]
采用同体左右侧自身对比法[…5]。取昆明种小鼠10只，随机分2组，即完整皮肤组和破损皮肤组。皮肤组的制备方法同急性毒性实验的制备。左侧涂抹TA-FNL凝胶0.5g,右侧涂抹等量的空白凝胶，每FI2次，连续用药14天。每次涂药前要脱毛，完整皮肤组不得损伤皮肤，以保证受试药物与皮肤充分接触。第15天时用温水清洁给药部位。于去除凝胶后1、24、48、72h观察涂抹部位皮肤是否有水肿及红斑现象，并记录实验结果。根据表6-2和表6-3进行皮肤反应积分和刺激强度评价。结果于除去TA-FNL凝胶后1、24、48、72h，完整皮肤组和破损皮肤组的涂药部位均未见红斑、水肿等现象，结果见表6-4。

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总结

本研究制备了 TA-FNL凝胶，并进行透皮释放研究。结果：研制的TA-FNL凝胶通过体外经皮渗透实验，发现TA-FNL凝胶与同浓度的普通凝胶相比，可显著地的提高TA的体外渗透量和皮肤滞留量，对治疗色素沉着类疾病打下良好的释药基础。
建立TA的测定方法，通过方法学考察，表明高效液相色谱法能够用于TA的测定。通过TA理化性质的研究，确定了 TA-FNL的制备方法为逆向旋蒸法，通过单因素实验和星点效应面优化法确定了 TA-FNL的最优处方和最佳工艺。在4°C条件下保存2个月，TA-FNL凝胶基本稳定。
考察中药天然促渗剂对TA-FNL凝胶的促渗效果。结果：TA-FNL凝胶的体外累积渗透量并不是辛夷挥发油的浓度越高效果越好。而皮肤滞留量与促渗剂的用量呈剂量依赖性，5%辛夷挥发油的促渗效果最强。
TA-FNL凝胶的初步稳定性结果表明在室温条件下保存6个月，各指标变化不大。微生物评价结果安全可靠；通过皮肤急性毒性实验、皮肤刺激试验和过敏性实验考察TA-FNL凝胶对皮肤的安全性，结果显示TA-FNL凝胶对皮肤无毒性、无刺激性、无过敏性。
截止2013年4月28日经查阅中文数据库和外文数据库，并未发现将TA制成柔性纳米脂质体再与凝胶剂结合的报道。实验证明，本研究制备的TA-FNL凝胶，能够显著地提高TA的累积渗透量和皮肤滞留量，是一种优良的治疗皮肤色素沉着等病症的外用制剂，其具有良好的稳定性，且对皮肤无毒性、刺激性和过敏性，安全可靠，故其在治疗皮肤色素沉着类疾病领域具有广阔的应用前景。
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参考文献（略）