淡色库蚊的生物活性及天然蚊虫受植物精油的防控剂研发

第一章文献综述

1.1 蚊虫的危害及其防制技术
1.1.1 蚊虫的危害
蚊虫是与人们生活与健康关系密切的卫生害虫，也是“四害”之一，具有种类多、分布广、繁殖快的特点（徐承龙和姜志宽 2006）。一方面，它们通过叮咬、骚扰等方式影响人们的生活；另一方面，它们是一类重要的传播疾病的媒介生物，能够传播包括登革热、疟疾、伤寒、鼠疫、丝虫病等在内的多种疾病，是目前世界上严重威胁人们生命健康的因素之一(Hemingway 2004; WHO 1996)。目前世界上已记载有37属119亚属3500余种蚊虫及其亚种，最常见的有库蚊属、按蚊数和伊蚊属（Marquardt 2004）。鉴于蚊虫不仅对人类进行叮咬、吸血和骚扰，而且还是多种疾病的传播媒介，因此，对蚊虫的防治收到了人们的广泛重视。
蚊虫对人类的影响首先是骚扰及物理性损害。有些蚊虫如淡色库蚊在夜间吸血，使人深受其扰不能正常休息；有些蚊种如白纹伊蚊是在日间叮咬人们，造成人们难以进行室外活动或野外作业，特别是在草原、森林、沼泽地带。可见，蚊虫对人类的生产、生活都有很大影响。另外，蚊虫对人的叮咬刺激使人感到瘙痒，产生的肿包被抓破后可能导致感染而产生皮炎或脓疮。
蚊虫对人类健康最大的威胁是传播疾病。蚊虫是多种疾病的传播媒介，目前已证实蚊虫可传播的疾病有60余种。从自然界的蚊虫中能够分离到很多病毒，其中包括一些人和动物的病原。我国常见的蚊媒病种类包括：疟疾、登革热、流行性乙型脑炎及丝虫病。疟疾是一种传播速度快、流行范围广、且能够反复爆发的传染病，在我国的流行历史久远，特别是20世纪30年代长江下游地区由于发生水灾，导致疟疾暴发流行，死亡30万人（徐承龙和姜志宽 2006）。近些年由于大力开展防疟工作，疫情得到很大程度的控制。从全球范围来看，世界上有一半以上的人都面临着被蚊虫传染疾病的威胁。疟疾在世界上90多个国家流行，每年因感染疟疾而死亡的人数约200万人。而全球受蚊媒病登革热和登革出血热威胁的人数达25亿之多，每年患病人数在1000万至2500万人。2014年6月，在我国广州爆发了登革热的疫情，这一突发性的公共卫生事件再次为我们敲响了警钟。由于目前尚无登革热疫苗，所以做好防蚊和灭蚊工作仍然是目前防治登革热流行的重要手段。
1.1.2 蚊虫的防制技术
蚊虫的防制是预防和控制蚊媒疾病的重要手段。有史以来，人类与蚊虫之间的斗争从未间断。人们用许多方法与蚊虫进行斗争，特别是近一个世纪以来有机合成杀虫剂的发展和使用，推动了蚊虫防制工作取得长足的进步，对蚊媒疾病的控制起到了至关重要的作用。总体来说，控制蚊虫的策略主要是降低幼虫、成虫的种群密度及减少蚊虫与人的接触。我国政府早在70年代就提倡“以环境治理为主的综合策略”，但在实际实践中，化学杀虫剂、杀蚊幼剂（生长调节剂或微生物杀虫剂）、化学驱避剂等方法来防制蚊虫。具体的防制策略可分为以下几种：
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1.2 蚊虫防控剂的应用现状及存在问题
1.2.1 蚊虫防控剂应用现状
卫生杀虫剂作为防止传染病的一项重要措施，是维持人类生活质量和身体健康的重要保障（蒋国民 2000）。因此，卫生杀虫剂的使用与人类的生产、生活及生命健康有着极为密切的关系。
卫生害虫杀虫剂按照其作用方式来分，概括起来有以下几种：（1）触杀剂：通过接触表皮或渗入虫体使其中毒死亡的药剂，如氯氰菊酯、溴氰菊酯等；（2）熏蒸剂：以单分子气体形态，通过呼吸系统进入虫体，使其中毒死亡的药剂，如溴甲烷、磷化氢等；（3）驱避剂：本身对害虫基本没有直接毒杀能力，但可驱避害虫，以保护人、畜不受侵害的药剂，如避蚊胺、避蚊酯等；（4）胃毒剂：通过消化系统进入虫体使其中毒死亡的药剂，如敌百虫等；（5）引诱剂：能引诱害虫前来接近，以便集中防治或调查虫情的药剂，常与胃毒剂共同使用；（6）粘捕剂：属物理防制，是用具有黏性的物质粘捕害虫的药剂。如粘蝇纸等。
目前主要卫生杀虫剂产品包括杀虫气雾剂、盘式蚊香、电热蚊香片、电热蚊香液，杀蚊幼剂、驱避剂等。
1.2.1.1 气雾剂
气雾剂是一个复杂的多元混合体系，由阀门、容器、内容物和抛射剂组成，内容物包括单一或复配的有效成分、溶剂及各种添加剂（表面活性剂、防腐蚀剂、稳定剂、增效剂等）。杀虫气雾剂中是应用最为广泛的家庭卫生害虫防控产品（Sugiura et al. 2008），具有以下优点：内容物被密封进罐体，性能稳定；体积小，使用简单，操作方便；能够直接对防治对象施药，作用迅速。杀虫气雾剂的有效成分最常用的药物是拟除虫菊酯类杀虫剂，一般包括击倒剂和致死剂（WHO1999），如胺菊酯、丙烯菊酯是击倒剂，氯菊酯、溴氰菊酯是致死剂。
杀虫气雾剂按照理化性质可以分为油基型、水基型和酊剂型；按针对靶标害虫的不同可以分为杀飞行害虫、杀爬行害虫、多种目的（如杀虫、抑菌、清新空气）以及全害虫用杀虫气雾剂。杀虫气雾剂经过长期的发展，为除害防病做出了重要贡献。随着科技发展与社会进步，传统的油基气雾剂由于具有挥发性有机气体，可能会破坏臭氧层，近年来气雾剂的发展有了新的趋势，如在剂型配方上，逐渐向醇基与水基的方向发展；气雾剂中的抛射剂向无毒无害的压缩气体（如氮气、二氧化碳和空气）方向发展。
1.2.1.2 盘式蚊香
自古以来，人类与蚊虫的斗争就从未间断过。从我国南宋时期就有类似驱蚊棒的文献记载。现代蚊香是1914年由日本人上山彦松利用阿基米德螺旋线和中国太极图组合成型，申请了世界上第一个蚊香专利。蚊香的构造较为简单，其原理是有效成分借助一定的载体和热源，在一定时间内稳定地挥发到空气中，从而达到驱杀蚊虫的作用（蒋国民2000）。蚊香主要由杀虫剂药剂、燃料和助燃剂等压制而成，在使用时通过燃烧产生的热源，使蚊香中的有效成分连续、均匀地释放到空气中，从而达到驱杀成蚊的作用效果。盘式蚊香燃烧点的温度高达700℃，在距离燃烧点约7-8毫米处蚊香的温度为160-170℃，该温度正好是用于蚊香中有效成分的挥发，随着蚊香的燃烧，温度点不断移动，从而保证了有效成分稳定挥发。
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第二章植物精油的杀蚊幼活性及水面杀蚊幼剂研究

由于蚊虫的卵、幼虫和蛹的生长发育都离不开水，因此在控制蚊虫的众多方法里面，最重要的也是最根本的措施是控制好蚊虫的孳生地，定期地使用杀虫剂消灭蚊虫孳生地的蚊虫，进而从源头上防止蚊虫的大量孳生，降低成蚊的密度。20 世纪中期以来，一些有机合成杀虫剂广泛地用于杀灭蚊子幼虫，在之后的很长一段时期内，有机合成杀虫剂在控制蚊虫及减少蚊媒疾病传播方面做出了重要贡献。化学杀蚊幼剂的施用方法一般为喷洒法，即根据各种药剂的推荐用量，用水稀释后对孳生地水面进行喷洒。
随着化学杀蚊幼剂使用时间的增加和用量的增大，也产生了一些突出的矛盾和问题，特别是化学合成杀虫剂的效果在逐渐降低，蚊虫产生抗药性的杀虫剂品种不断增多，抗性增长的速率也不断加快，蚊虫产生抗性的地区和范围不断扩大。而且由于有些传统化学杀虫剂在环境中降解缓慢，很容易引起在环境中的残留和污染，在生态圈和食物链中给人类的生命健康带来隐患。因此，研究和开发新型、高效、低毒的杀蚊幼剂品种是蚊虫防控领域中的一个重要课题。
植物精油具有选择性强、对人畜低毒、对环境无污染等优点，其杀虫作用机制独特，并且昆虫不易产生抗药性的特点。国内外的科学家致力于从植物中提取高效、低毒、价廉的替代型杀蚊幼成分，其中对植物精油的杀蚊幼活性进行了大量的研究，也筛选出了一些具有较好活性的精油或其成分，但主要侧重于精油提取和活性筛选，而制剂开发和应用方面的研究较少。植物精油作为杀蚊幼剂在制剂加工上有一定难度，主要是由于精油的挥发性，目前的研究侧重于将其加工成缓释剂型。总体而言，由于杀蚊效果、使用成本等因素的限制，植物精油杀蚊幼剂的应用还比较少。
植物精油杀蚊幼活性一般较化学农药差，使用剂量、效果和成本与化学农药相比没有优势。另外，在杀蚊幼剂的制剂加工和产品研制方面，要注意杀蚊幼剂在实际使用中应尽量降低对水体环境的影响。基于以上两方面的考虑，以及蚊子幼虫的生物学习性，即蚊子的幼虫在水中每隔一段时间就要到水面上获取氧气，可以得到以下启发：如果能使具有杀蚊幼的精油或其组分在水面铺展成油膜，即通过添加一些天然助剂将其加工成类似于农药剂型中展膜油剂的水面杀蚊幼剂，将会大大降低实际应用中精油或其组分的使用剂量，并减少对水体环境的影响。
因此，在前期研究的基础上，本研究选用 60 种植物精油及精油组分，包括 25 种常见的植物精油及 35 种具有代表性的精油单体化合物，系统研究它们对淡色库蚊幼虫的毒杀活性，并对活性成分的协同增效作用以及基于植物精油的水面杀蚊幼剂制剂加工及使用效果方面做一些研究和探讨。

2.1 材料与方法
2.1.1 供试材料
2.1.1.1 供试昆虫
淡色库蚊（Culex pipiens pallens）为从西安市疾病预防控制中心引种并且未接触过任何杀虫剂的敏感品系，在西北农林科技大学无公害农药研究服务中心卫生害虫养虫室内饲养。饲养条件为：温度 26±1℃，相对湿度 65%± 10%，光照周期为 L/D：12h/12h。杀蚊幼试验时挑选大小一致、健壮的 4 龄幼虫供试。
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2.2 结果与分析
2.2.1 植物精油对淡色库蚊幼虫的毒杀活性
采用药液浸养法测定了 25 种植物精油对淡色库蚊 4 龄幼虫的毒杀活性，结果见表2-3。

从表 2-3 中结果可以看出，25 种天然植物精油中，八角茴香油、八角叶油、肉桂油和香叶油对淡色库蚊幼虫具有较好的毒杀活性，80 mg/L 浓度下淡色库蚊 4 龄幼虫 24h死亡率分别为 95.0%、93.8%、87.5%和 80.5%；其他精油对淡色库蚊 4 龄幼虫的 24h 死亡率均低于 70%，其中蓝桉油、丁香叶油、桉叶油、冬青油、白樟油、松节油和艾叶油在 80 mg/L 浓度下对淡色库蚊 4 龄幼虫无毒杀活性。
2.2.2 植物精油单体化合物对淡色库蚊幼虫的毒杀活性
采用药液浸养法测定了35种植物精油单体化合物对淡色库蚊4龄幼虫的毒杀活性，结果见表 2-4。

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第三章植物精油对淡色库蚊的熏蒸活性及电热蚊香片研制 ........................ 29
3.1 材料与方法........................................ 30
3.1.1 供试材料 ........................................ 30
3.1.2 试验方法 ....................................... 30
3.2 结果与分析............................................ 32
3.2.1 25 种植物精油对淡色库蚊的熏蒸活性 ................................... 32
3.2.2 冬青油与肉桂油的有效成分研究 .................................... 35
3.2.3 水杨酸甲酯与反式肉桂醛的混配增效研究 .................................. 39
3.2.4 35 种植物精油单体化合物对淡色库蚊的熏蒸活性 ......................................... 41
3.2.5 几种精油单体化合物的结构与熏蒸活性之间的关系 ...................................... 43
3.2.6 几种植物精油单体化合物的协同增效研究 .................................. 44
3.2.7 基于香芹酚和百里香酚的植物源电热蚊香片研制及其药效测试 .............................. 45
3.3 讨论............................................ 47
3.3.1 植物精油及其组分在亚致死剂量下对蚊虫的生物活性需要引起重视 .................................. 47
3.3.2 要加强对植物精油有效成分及其协同作用的研究 .............................. 47
3.3.3 植物精油中酚类化合物的熏杀活性及其作用机理需要进一步研究 ........................ 48
3.3.4 香芹酚和百里香酚具有开发成为植物源电热蚊香片的潜力 ............................... 48
3.4 小结........................................... 49
第四章植物精油及精油单体化合物对淡色库蚊的驱避活性及天然驱避剂研究 .............. 50
4.1 材料与方法.............................................. 51
4.1.1 供试材料 ................................. 51
4.1.2 试验方法 .................................... 51
4.2 结果与分析.................................... 52
4.2.1 25 种植物精油对淡色库蚊的空间驱避活性测定结果 ..................................... 52
4.2.2 35 种植物精油单体化合物对淡色库蚊的空间驱避活性筛选 ......................... 53
4.2.33 种植物精油单体化合物的增效复配及其驱蚊活性 ........................................ 55
4.2.4 水凝胶型固体缓释驱蚊剂的研制 ........................................... 56
4.3 讨论与小结............................................... 57
4.3.1 反式肉桂醛与香叶醇具有开发成为天然驱蚊剂的潜力 .................................. 57
4.3.2 水凝胶型固体缓释技术较适宜于驱蚊精油缓释剂 ............................ 58
4.3.3 植物精油的驱蚊作用及其机理需要进一步研究 .............................................. 58
4.3.4 植物精油驱蚊剂的活性评价方法和标准有待于进一步完善 ......................... 58

第五章几种植物精油单体化合物对天然除虫菊素的增效活性及植物源增效剂研制

杀虫增效剂是农药加工和使用中的一类重要助剂，其本身对害虫无直接毒杀作用，但与杀虫剂原药混配使用时，能增加杀虫效果，降低原药用量和成本。目前杀虫增效剂在卫生杀虫剂领域应用较多，常用的有增效醚、增效胺等。增效剂在蚊虫防控剂中的使用具有重要意义，一方面由于拟除虫菊酯类杀虫剂在蚊虫防控领域的连续、大量使用，蚊虫已经产生了一定的抗药性，导致卫生杀虫剂的药效逐渐降低，蚊虫防控难度越来越大，而增效剂在缓解和治理害虫抗药性方面具有独特的作用；另一方面，新型杀虫剂的开发难度不断增大，短时期内无法寻找到这些传统药剂的合适替代品。因此，研究和开发环保、高效的杀虫增效剂越来越受到重视。
植物精油是植物体内次生代谢产生的挥发性小分子化合物，资源丰富，来源广泛，对昆虫具有复杂多样的生物活性。一般来讲，植物精油对昆虫的毒杀活性一般比化学合成杀虫剂要低，但研究发现植物精油在亚致死剂量下对杀虫剂可能具有增效作用，增效的方式包括抑制昆虫体内代谢解毒酶的活性、增强药剂对昆虫体壁的穿透性、刺激昆虫的感受器官并干扰其行为等。目前大多数研究都集中在植物精油对害虫的毒杀作用，而对其增效作用的研究较少。
天然除虫菊素是从除虫菊中提取的杀虫成分，具有易降解、残留少及害虫不易产生抗药性等优点。但与化学合成的拟除虫菊酯类农药相比，天然除虫菊素存在药效偏低、生产成本过高等问题，限制了其在卫生杀虫剂中的推广和应用。本研究在前期筛选的基础上，选用杀蚊幼活性较好的反式茴香烯与金合欢醇，熏蒸活性较好的水杨酸甲酯、反式肉桂醛、香芹酚与百里香酚，以及驱蚊活性较好的香叶醇等几种单体化合物，研究了它们对天然除虫菊素的增效活性，为开发天然除虫菊素和植物精油混配增效的植物源卫生杀虫气雾剂提供参考和依据。

5.1 材料与方法
5.1.1 供试材料
5.1.1.1 供试昆虫
淡色库蚊（Culex pipiens pallens）为从西安市疾病预防控制中心引种并且未接触过任何杀虫剂的敏感品系，在西北农林科技大学无公害农药研究服务中心卫生害虫养虫室内饲养。饲养条件为：温度 26±1℃，相对湿度 65%± 10%，光照周期为 L/D：12h/12h。试验时挑取羽化后第 3d 的整齐一致健康雌蚊供试。
5.1.1.2 供试样品
选用前期筛选出来的几种杀蚊幼、熏蒸、驱蚊较好的精油单体化合物，分别为：反式茴香烯、金合欢醇、水杨酸甲酯、反式肉桂醛、香芹酚、百里香酚和香叶醇。
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第六章讨论与结论

6.1 讨论
6.1.1 天然辛香料植物精油对蚊虫的生物活性值得关注
本研究发现天然辛香料植物精油―八角茴香油中的反式茴香烯以及肉桂油中的反式肉桂醛对淡色库蚊具有明显的生物活性，具有开发成为植物源蚊虫防控剂的潜力。天然辛香料植物作为食品调味品，在我国饮食结构中起着重要作用。我国是辛香料生产大国和出口大国，辛香料植物资源丰富，品种数和产销量居于世界前列（时艳玲 1997）。研究表明辛香料植物的精油成分具有防腐抑菌、抗氧化、杀虫、保健等功能（顾仁勇等2008）。除了在食品行业中有着广泛应用之外，其在农业、卫生、日化等行业中的应用价值也有待于进一步开发。辛香料植物精油作为可食用的天然成分，对人体安全无害，对环境无污染，并且资源丰富、成本低廉，在蚊虫防控剂研究和开发中有着独特的优越性，具有开发成为天然蚊虫防控剂的潜力，值得进一步扩大筛选和深入研究。目前有关辛香料植物精油对蚊虫的生物活性的研究并不多，彭映辉等人（2010）的研究表明，岭南花椒精油对白纹伊蚊和致倦库蚊的幼虫、蛹及成蚊均具有一定的毒杀作用；张云等人（2010）研究了竹叶花椒果实精油对白纹伊蚊和致倦库蚊幼虫及成蚊的毒杀作用。作者所在的西北农林科技大学无公害农药研究服务中心“天然源卫生害虫防控剂课题组”在植物精油对蚊虫的生物活性方面进行了多年的研究，已报道了一些研究成果，如发现荆芥精油对白纹伊蚊具有优异的驱避活性，并将其开发成微胶囊制剂（Wu et al.2013）。由于本研究选用的植物精油种类和数量有限，而我国辛香料植物种类繁多、品种丰富，产品包括桂皮、生姜、大蒜、洋葱、胡椒等近 200 个品种，因此仍需进一步扩大对我国辛香料植物精油及其成分的生物活性筛选，有望从中发现具有更好防控蚊虫作用的活性物质。
6.1.2 基于作用方式和剂量的不同，植物精油对蚊虫具有复杂多样的生物活性
本研究发现植物精油或其组分对淡色库蚊幼虫具有毒杀活性，对淡色库蚊成虫具有熏蒸毒杀和空间驱避活性，对天然除虫菊素具有增效活性。这些结果表明植物精油可以通过不同的作用方式对蚊虫表现出不同的生物活性。比如：杀蚊幼试验采用的是药液浸养法，植物精油在水体中对淡色库蚊幼虫可能具有触杀或胃毒作用；熏蒸活性和驱避活性研究考查的是精油中的单体化合物在气体分子状态下对淡色库蚊成虫的生物活性，气体分子状态的精油单体化合物在较高浓度下通过蚊虫体壁的气门进入虫体，进而影响蚊虫的呼吸系统或神经系统（马志卿等 2009；张云等 2013），而在低浓度下作用于蚊虫触角的嗅觉感受器，进而产生不同的神经电流信号使蚊虫的行为发生改变，驱避效果的形成就是驱避剂分子与嗅觉蛋白之间的一系列生理生化反应的结果（廖圣良等 2011）。
本论文的研究结果表明，由于供试剂量、作用对象、筛选目的和活性评价方法的不同，植物精油对淡色库蚊的作用方式和生物效果也不相同。如采用药液浸养法进行杀蚊幼活性筛选，35 种精油单体化合物中，反式茴香烯对淡色库蚊幼虫具有明显的毒杀活性，但在三角瓶密闭熏蒸法测定对淡色库蚊成虫的熏蒸活性时，反式茴香烯在供试剂量下基本无熏蒸活性。另一方面，蚊虫防控是一项系统工程，需要建立一个基于蚊虫防控剂的综合防控技术体系，比如用于防控蚊虫幼虫的杀蚊幼剂，用于防控室内成蚊的气雾剂、电热蚊香片、电热蚊香液等药剂，用于防控室外蚊虫的喷洒滞留剂、驱避剂等药剂。因此，在筛选植物精油及其组分对蚊虫的生物活性的研究中，要注重考查其不同作用方式及供试剂量下对蚊虫的生物活性，通过设置不同的试验方法和筛选模型，对其生物活性做以系统筛选，对其防控蚊虫的生物活性做以综合评价，为开发不同产品类型和防控功能的植物源蚊虫防控剂提供基础和参考。
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参考文献（略）