芽抱杆菌Bacillus sp.A50透明质酸酶的研究

第一章研究背景与立题依据

1.1透明质酸
1.1.1透明质酸的来源与结构
透明质酸（hyaluronic acid,HA），又名玻璃酸，是一种高分子酸性點多糖，广泛存在于动物的组织细胞间质和某些细菌的荚膜中。1934年Meyer等首先从牛眼玻璃体中分离出该物质⑴，并命名为hyaluronic acid。HA是由葡糖酸酸和iV-乙酷氨基葡糖组成的双糖重复单位构建成的直链多糖（图1-1）[2]。

由于来源不同，HA分子链的长度及分子量差别很大，分子量范围为10 kDa至lOOOOkDa，双糖单位数为25~25000。商品HA—般为钠盐形式，为白纤维状或粉末状固体，有较强的吸湿性，溶于水，不溶于有机溶剂，药用级分子量为1000kDa~4000 kDa,化妆品级为500 kDa~1500 kDa。然而，不同来源的HA无种属差异，对人类及动物无抗原性。
对HA稀溶液进行的光散射研究发现[3，4], HA在水溶液中呈现单螺旋状态，分子内的氢键使其形成螺旋结构。而当HA溶液达到一定浓度时，HA分子形成双螺旋。随着HA浓度增加，HA在水溶液中将呈现三维网状结构。
Scott等借助旋转阴影电子显微镜及计算机模拟手段，提出了 HA的三级结构。HA分子中的每3个单糖单位均有一块疏水区域，该区域由8个CH （相当于一个正辛焼）组成[5]。HA分子上交替分布的疏水区域相互作用，使HA形成双螺旋结构，这是HA分子相互聚集的基础。HA的网状结构展现了单独的HA分子并不具有的一些特殊性质。当受到较快或短时冲击时，溶液显示弹性特征以分散这股力量；当受到较慢或长时间的冲击时，由于分子有时间解开彼此间的缠绕，溶液显示黏性特征[6]。HA注射液缓解关节疼痛即是利用该性质。
HA的生产主要分为动物组织提取法及细菌发酵法。几乎所有的动物组织中均含有HA，含量较高能够用于工业生产的原料主要为鸡冠和人挤带。随着HA用途越来越广泛，而动物来源的原料有限，提取法已经越来越无法满足工业化生产的需要。细菌发酵法是利用某些以HA为主要荚膜成分的链球菌，通过对菌株蹄选、诱变，优化发酵条件，极大程度上提高了 HA的产量，降低了生产成本[7]。细菌发酵法与动物组织提取法相比，具有生产规模不受动物原料限制，发酵液中HA以游离状态存在，易于分离纯化，成本低，易于形成规模化工业生产，无动物来源的致病病毒污染的危险等优点。
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1.2透明质酸酶
1.2.1透明质酸酶的发现
透明质酸酶是一类能够降解HA的酶的总称。早在1928年Duran-Reynals在研究哺乳动物睾丸及其他组织提取物时发现了一种“扩散因子”，可以促进皮下注射的疫苗、染料、毒素等更好地扩散[12]。1940年Meyer将这种“扩散因子”命名为HyaluronidaseP此后，在人体多种组织及多种生物体内也检测到了透明质酸酶，包括人体的睾丸、肝脏、肾脏、脾脏；细菌、真菌以及非脊椎动物如水輕、甲壳类动物；不同来源透明质酸酶在分子量、底物特异性、最适pH以及降解机制上各不相同。
1.2.2透明质酸酶分类
1971年Meyer根据透明质酸酶作用机制的不同，将它分为3类（见图1-2）：
(1)内切p-iV-乙酰氨基葡糖苷酶（EC 3.2.1.35）该类酶为水解酶，作用于p-l，4糖苷键，终产物主要为四糖，也可作用于软骨素或硫酸软骨素，同时具有水解及转糖苷酶活性。哺乳动物来源的以及动物毒液来源的属于此类，研究最多的是睾丸、蜂毒以及溶酶体透明质酸酶。
(2)水輕、十二指肠虫来源的透明质酸酶（EC3.2.1.36）该类酶为内切-P-葡糖苦酸酶，特异性降解HA,作用于P-l，3糖苷键，因此在降解产物的还原端具有糖醛酸残基，终产物为四糖、六糖。
(3)细菌透明质酸酶（EC 4.2.2.1）该类酶也称为透明质酸裂解酶（hyaluronatelyase）,作用于p-l，4糖苷键，通过p-消去机制得到4，5-不饱和双糖。一些菌属如Streptococcus、StapPlococcus> Clostridium、Propionibacterium、Peptostreptococcus>Streptomyces等均可产生透明质酸酶[32，33]，只是它们在底物特异性上表现不同。
随着分子技术的发展，根据透明质酸酶序列的同源性，透明质酸酶也可以简单地分为原核生物透明质酸酶和真核生物透明质酸酶两大类。

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第二章透明质酸酶产生菌株的蹄选与鉴定

2.1引言
近年来，随着透明质酸酶在美容、医疗、多糖基础研究及寡糖制备等领域的不断深入，动物来#的透明质酸酶因资源有限、含量低、成本高、动物病毒感染等问题，已远远不能满足研究的需要。微生物透明质酸酶因其来源广、发酵工艺简单、成本低、纯度高、环境污染少等优点，受到更多的青睐。
可产透明质酸酶的微生物很多，但酶活大都较低。目前，国际上报道的微生物产透明质酸酶生产水平最高为591 U/mL[71]，不能满足大规模工业化的生产。因此，选育透明质酸酶高产菌株是本课题的一个研究重点。
本章以空气中的沉降菌为蹄选样本，采用高通量的菌株筛选方法和快速的酶活测定方法，蹄选得到一株透明质酸酶高产菌株并对菌株的种属进行鉴定。
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2.2试验材料、试剂与仪器
2.2.1实验样品来源
样品来源：华熙福瑞达生物医药有限公司发酵实验室及生产车间空气沉降菌。
2.2.2主要仪器
INFORS Multitron Standard恒温振荡培养箱，伊孕森生物技术有限公司，瑞士；
DK-8D数显恒温水浴锅，金坛市医疗仪器厂；
岛津UV-1800紫外分光光度计，SHIMADZU，日本；
3SK30型冷冻离心机，SIGMA，美国；
LAZX-40CI型立式自动电热压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；
SW-CJ-1F洁净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；
10 L发酵罐，常州三高生物技术工程设备有限公司；
PCR仪，卡尤迪生物科技（北京）有限公司；
电泳仪，北京百晶生物技术有限公司；
凝胶成像系统，美国BIO-RAD科技；
LAZX-40CI型立式自动电热压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂。
2.2.3试剂
透明质酸（HA，Mw IX10'Da）,华熙福瑞达生物医药有限公司；
细菌基因组DNA提取试剂盒，天稂生化科技（北京）有限公司；
牛血清白蛋白（BSA),葡萄糖，琼脂粉，K2HP(V3H20，MgS(V7H20,Na2HP04 l2H20, NaH2P(V2H20，MgS(V7H20等，国药集团化学试剂有限公司；
蛋白胨，酵母粉，英国OXOID公司。
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第三章芽孢杆菌Bacillus sp.A50发酵工艺优化................................... 34
3.1引言................................... 34
3.2试验材料、试剂与仪器................................... 34
3.2.1 菌株................................... 34
3.2.2主要仪器................................... 34
3.2.3 试剂................................... 34
3.2.4培养基................................... 35
3.3试验方法................................... 35
3.3.1相对醜活测定................................... 35
3.3.2浊度法测定酶活（中国药典法）................................... 35
3.3.3摇瓶中优化发酵培养基................................... 37
3.3.4 10 L发酵耀中透明质酸酶发酵工艺的研究................................... 38
3.4结果与分析................................... 39
3.4.1碳源对透明质酸酶发酵的影响................................... 39
3.4.2葡萄糖浓度对透明质酸酶发酵的影响................................... 39
3.4.3氮源对透明质酸酶发酵的影响................................... 40
3.4.4复合氮源对透明质酸雜发酵的影响................................... 40
3.4.5磷酸盐对透明质酸酶发酵的影响................................... 41
3.4.6 KH2P04浓度对透明质酸雜发薛旳影响................................... 41
3.4.7 Mg2+浓度对透明质酸酶发酵的影响................................... 42
3.4.8 pH对透明质酸酶发酵的影响................................... 43
3.4.9发酵温度对透明质酸酶发酵旳影响................................... 43
3.4,10转速对透明质酸酶发酵的影响................................... 44
3.4.11通气量对透明质酸酶发酵的影响................................... 44
3.4.12发酵时间对透明质酸酶发酵的影响................................... 45
3.4.13优化发酵工艺后透明质酸酶发酵液的酶活................................... 45
3.5讨论................................... 46
第四章芽孢杆菌Bacillus sp.A50透明质酸酶的分离纯化................................... 47
4.1引言................................... 47
4.2试验材料、试剂与仪器................................... 47
4.2.1发酵液................................... 47
4.2.2主要试剂及耗材................................... 47
4.2.3主要仪器设备................................... 48
4.3试验方法................................... 48
4.3.1粗提液的制备................................... 48
4.3.2阴离子交换层析................................... 48
4.3.3凝胶过滤层析................................... 48
4.3.4浊度法测定酶活（中国药典法）................................... 49
4.3.5考马斯亮蓝法测定蛋白质含量................................... 49
4.3.6 SDS-PAGE 494.4结果与分析................................... 50
4.4.1离子交换层析................................... 50
4.4.2凝胶过滤层析................................... 51
4.4.3 HAase-5纯度和得率分析................................... 52
4.5 脱 52第五章透明质酸酶HAase-5的酶学性质研究................................... 53
5.1引言................................... 53
5.2试验材料、试剂与仪器................................... 54
5.2.1透明质酸酶................................... 54
5.2.2主要试剂及耗材................................... 54
5.2.3主要仪器设备................................... 55
5.3试验方法................................... 55
5.3.1相对酶活测定................................... 55
5.3.2最适反应温度测定................................... 55
5.3.3热稳定性测定................................... 56
5.3.4最适反应pH测定................................... 56
5.3.5 pH苹急定性测定................................... 56
5.3.6底物溶液中Na2HP04-NaH2P04缓冲液浓度对酶活影响................................... 56
5.3.7底物溶液中NaCI浓度对酶活影响................................... 57
5.3.8金属离子、金属离子螯合剂及表面活性剂对酶活影响................................... 57
5.3.9底物特异性实验................................... 57
5.3.10 HAase-5降解HA及CSA酶动力学参数测定................................... 57
5.4结果与分析................................... 58
5.4.1最适反应温度及热稳定性................................... 58
5.4.2最适反应pH及不同pH下的稳定性................................... 59
5.4.3 NaCI及Na2HP04-NaH2P04缓冲液浓度对酶活的影响................................... 59
5.4.4金属离子、金属离子螯合剂及表面活性剂对海活影响................................... 60
5.4.5 HAase-5的底物特异性研究................................... 61
5.4.6 HAase-5降解HA及CSA酶动力学研究................................... 62
5.5讨论................................... 64
第六章芽孢杆菌Bacinus sp. A50分泌的透明质酸酶HAase-5基因测序及序列分析.....................................65
6.1引言................................... 65
6.2试验材料、试剂与仪器................................... 65
6.2.1主要试剂与仪器................................... 65
6.2.2数据库及分析软件................................... 66
6.3试验方法................................... 66
6.3.1芽孢杆菌Bacillus sp. A50全基因组初步测序................................... 66
6.3.2 HAase-5 的 N 端测序................................... 66
6.3.3 HAase-5 的肽谱分析(ESI-Q-TOF2) ................................... 66
6.3.4 HAase-5肽段序列与Bacillus sp. A50基因组DNA序列信息比对................................... 66
6.4结果与分析................................... 67
6.4.1芽孢杆菌Bacillus sp. A50全基因组初步测序结果................................... 67
6.4.2 HAase-5的N端序列和内肽序列测定结果................................... 67
6.4.3编码HAase-5基因(hyl)力序列的获得................................... 67
6.4.4 hyl基因白勺序列分析................................... 74
6.5讨论................................... 76

第七章寡聚透明质酸的酶切法制备及生物活性研究

7.1引言
透明质酸(HA)广泛分布于哺乳动物的细胞外基质,低分子量HA(LMW-HA)W或寡聚HA (oligo-HA)具有许多不同于中高分子量HA的独特生物活性，因此HA的降解产物的研究越来越受到医药、食品、美容等行业的重视，例如oligo-HA可以促进血管生成、诱导多种炎性因子的产生（如细胞因子、趋化因子、基质金属蛋白酶等)、抑制肿瘤生长等。
与其它化学降解方法相比，酶切法制备寡糖的反应条件温和、副产物少、寡糖产物纯度高、生物活性强。本章利用芽孢杆菌及Jcz7/wysp.A50分泌的透明质酸酶HAase-凡釆用酶切法制备oligo-HA,对降解产物进行质量分析，并考察酶切法oligo-HA的抗氧化和促血管生成活性。

7.2试验材料、试剂与仪器
7.2.1主要试剂耗材
不同分子量的HA和透明质酸酶（HAase-5，8xl04 lU/mL）,华熙福瑞达生物医药有限公司；HA双糖标准品（ADiHA，纯度2 95%）、光谱纯溴化钾（KBr）、苯紛、四甲基偶氮唾蓝（噻挫蓝，MTT）以及二甲基亚讽（DMSO）, Sigma-Aldrich；活性氧检测试剂盒，购自碧云天；其它试剂均为分析纯，购自国药控股股份有限公司。
7.2.2细胞株及培养基
L-929小鼠成纤维细胞、EA.hy926人骄静脉内皮细胞，购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库；HaCaT人表皮角化细胞，购自上海拜力生物科技有限公司；RPMI-1640培养基、DMEM高糖培养基和胎牛血清购自Gibco。
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全文总结与展望

1总结
本课题对芽孢杆菌Bacillm SP.A50产的透明质酸酶进行了系统研究，主要的创新研究成果总结如下。
1.1从自然界中筛选出一株新的透明质酸酶高产菌株
从空气中分离得到了一种产透明质酸酶菌株，对其生理生化特征进行了研究，并对该菌株进行鉴定，确定为芽孢杆菌属，命名为Bacillus sp. A50，保藏号为 CGMCCNO. 5744。
1.2该菌株分泌的透明质酸酶是一种新的透明质酸裂解酶
获得了 HAase-B基因的完整核苦酸序列及HAase-B的氨基酸残基序列，核苷酸序列同源性分析未发现与其核苗酸序列同源的序列，说明HAase-5基因是一种新的基因。氨基酸残基序列同源性分析表明，与HAase-5氨基酸残基序列相似性最高的蛋白质是一种解藻阮类芽孢杆菌(Paenibacillus alginofyticus)的黄原胶裂解酶XalB前体，相似度为46%,表明本研究发现的HAase-5为一新的透明质酸裂解酶。
1.3优化后的发酵酶活达到国际领先水平
本课题对SP.A50产透明质酸酶发酵培养基、发酵条件进行了优化。经过发酵优化，发酵液的酶活可达到1.5X105U/ml，比活>107U/mg，远高于文献报道中的最高酶活，使大规模酶切法生产LMW-HA和oligo-HA成为可能。
1.4透明质酸酶的制备及酶学性质研究
本课题通过对透明质酸酶发酵液进行离心、盐析、离子交换层析、凝胶过滤层析纯化透明质酸酵，经纯化获取的透明质酸酶命名为HAase-5。研究反应条件和稳定性等酶学性质，为制备LMW-HA和oligo-HA提供依据。
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参考文献（略）